اتیلن
مشخص شده ا ست که کشت اندام نیز همانند کشت کالوس ، قادر به تولید هورمون گازی اتیلن می باشد (ملی و همکاران ۱۹۸۲) . از ان جایی که در بعضی موارد لوله های ازمایش ، فلاسک و خصوصا ظروف پلاستیکی کاملا بسته می شوند ؛ باید مراقب بود که تجمع اتیلن ، حادث نشود . از طرف دیگر ، ظروف پلاستیکی نیز تولید اتیلن می کنند ، که بایستی در هنگام استفاده از انها ، مواظبتهای خاص ، اعمال شود . روشن کردن کبریت و ایجاد شعله نیز ، تولید اتیلن می کند ، لذا نباید این عمل را در داخل محفظه با جریان هوای استریل (اتاقک تمیز ) انجام داد . ملی و همکاران (۱۹۸۲) اثر روشهای مختلف بستن درب ظروف مورد استفاده در کشت این ویترو را ، روی رشد سرشاخه های میخک ، بررسی و نتیجه گیری کرده اند که در اثر بستن درب ظروف ، تجمع اتیلن ، اتفاق می افتد ، و منجر به ممانعت از رشد ، می شود . اگر KMnO4 اضافه شود ( در یک لولۀ جداگانه ) در این صورت ٧۰ درصد از اتیلن می تواند حذف شود .
در منابع علمی ، گزارشات متفاوتی در مورد نقش اتیلن در اندام زایی وجود دارد . موارد بی اثر بودن اتیلن روی جنین زایی و در بعضی موارد ، اثر مثبت ان ، گزارش شده ا ست . در یک ازمایش ، ملاحظه شد که وقتیکه کالوسهای توتون در نور رویانیده شدند (هاکستر و همکاران ۱۹۸۱) ، تولید اتیلن ، در حالتی که شاخه های نابجا تشکیل شدند ، همچنین نتایج این ازمایش ، نشان داد که تشکیل اتیلن ، بستگی به دورۀ زمانی بعد از واکشت (اتیلن بیشتری در ۵ روز اول ، نسبت به ۶ تا ۱۰ روز بعدی ، تولید شد) و در رﮊیم نور / تاریکی (اتیلن بیشتری در تاریکی نسبت به روشنایی تولید شد )دارد . نامبردگان نتیجه گیری کرده اند که اتیلن در طول ۵ روز اول کشت ، جنین زایی را کاهش می دهد ، در حالی که تمایز ساقه (بطور قابل رویت ) در ۶ تا ۱۰ روز بعد از کشت ، تسریع شد وان ارتریجک (۱۹۸۴)، و وان ارتریجک و همکاران (۱۹۸۶) نشان داده اند که با تولید گیاه جدید از قلمۀ لاله ، تولید اتیلن و اتان ، به همان اندازه که بستگی به مرحله ای که رشد مجدد در حال انجام ، دارد ؛ بستگی به شرایط رشد نیز دارد . با توجه به تولید اتیلن بیشتری در دو هفتۀ اول کشت ، تعداد پیازهای نابجا، به نظر بیشتر بود . بنابراین ، به نظر می رسد که اتیلن (بیوسنتز اتیلن ) نقش مهمی را در تشکیل پیازهای نابجا ، دارد . زمانی که بیوسنتز اتیلن در لاله توسط [32]AVGوقف شد ، تشکیل پیاز نابجا نیز متوقف شد . افزایش اتیلن ( ۱ تا ۱۰ پی پی ام ) طی۳ تا ٧ روز در دورۀ رشد ، تشکیل پیاز نابجا را تسریع می کند ، به همان گونه که افزایش [33]ACCاین عمل را انجام می دهد .
همچنین ، به نظر می رسد که اتیلن روی جنین زایی و تشکیل اندام در بازدانگان ، اثر دارد ، ورهگین و همکاران(۱۹۸۶) نشان داده اند که کالوس غیر جنینی در گیاهpicea abies ، ۱۰ برابر بیشتر از کالوس جنینی ، اتیلن تولید می کند .کومار و همکاران ( ۱۹۸۶) نشان دادند که تجمع اتیلن و Co2 در طولاولین هفتۀ کشت در فلاسکهای ارلن مایر ، تشکیل شاخه های نابجا را در کوتیلدونهای جداشدۀ کاج ( Pinus radiate ) تسریع می کند . زمانی که اتیلن و Co2 از فلاسکهای حذف شده ، رشد مجدد ساقه و نیز متوقف شد . 97
در بعضی موارد ، رشد در محیط این ویترو ، می توا ند به وسیلۀ اتیلن ، تسریع شود (ا ستوتیمایر و برایت ۱۹٧۰؛ پالمر . بارکر ۱۹٧۳؛ مکنزی و ا ستریت ۱۹٧۰ و بوریکت ۱۹٧۲). به نظر می رسد که غلظت خاصی از اتیلن برای ایجاد تقسیم سلولی ، ضروری است ، مکنزی و استریت (۱۹٧۰) در کشتهای سوسپانسیون سلولی افرا ( Acer ) مشاهده کردند که تو ، فور –دی باعث تشکیل اتیلن می شود .
8- 4 – 6 – ویتامینها 98
در بعضی موارد ، از یک یا چند ویتامین ذیل ، در کشت این ویترو استفاده می شود ( اسامی دیگر آنها و غلظتهای به کار برده شده بر حسب میلی گرم در لیتر ، در داخل پرانتز ، آمده است ) :
اینوسیتول ( میو اینو سیتول ، مزو اینوسیتول ، 100 تا 200 ) ، ویتامین B1 ( تیامین ، آدنوزین : 1/0 تا 5 ) ، کلسیم پانتوتناب یا اسید پانتوتنیک ( 5/0 تا 5/2 ) ، اسید فولیک ( ویتامین M ، 5/0 تا 1 ) ؛ ریبوفلاوین ( لاکتوفلاوین ، ویتامین B2 ، 1/0 تا 10 ) ؛ اسید اسکوربیک ( ویتامین C ، 1 تا 100 ) ؛ اسیدنیکوتینیک ( وی تامین PP ، نیاسین ، 1/0 تا 5 ) ؛ پیریدوکسین ( آدرمین ، ویتامین B6 ، 1/0 تا 1 ) بیوتین ( ویتامین H ، 01/0 تا1 ) ؛ پاراآمینواسید بنزوییک ( 5/0 تا 1 ) ؛ توکوفرول ( ویتامین E ، 1 تا 5 ) .
غلظت بالای اسید اسکوربیک که بعضی موارد اضافه می شود ، به این معنا نیست که گیاه چنین نیاز بالایی دارد . ویتامین C در غلظت بالا ، به عنوان آنتی اکسیدان ، به کار می رود . بسیاری از گیاهان قادرند که ویتامینها را در حالت این ویترو ، سنتز کنند ؛ و این موضوع مورد سوال است که آیا واقعاً همیشه افزودن مداوم مخلوط ویتامینها طی کشت این ویترو ضرورت دارد .
9 – 4- 6- سایر مواد متفرقه
پلی آمینها
آزمایشات نشان می دهد که پلی آمینها در جریان جنین زایی در تمایز سلولی و نمو دخالت دارند بطوری که اساساً میزان پلی آمینهای درونزا ، خصوصاً پوترسین و اسپرمیدین در طول تشکیل جنین در هویج افزایش پیدا می کند . جنین زایی ، با افزودن ممانعت کننده های سنتز پلی آمین متوقف شده ، و با افزایش مجدد پوترسین ، اسپرمیدین ، برگشت پیدا می کند .
اثرات مشابهی نیز در یونجه (Medicage sativa) گزارش شده است ( شفیدر و مکنذی 1986). روگینی و وانگ ( 1986 ) دریافته اند که پلی آمینها کوفاکتورهایی برای تشکیل ریشه های نابجا ، هستند . نکته جالب دیگر ، این که پوترسین قادر به تطابق ( همزمان کردن رشد ) مرحله
جنین زایی در هویج (Daucus carota) است ( برولی و همکاران 1985) .
بنابراین ، می توان نتیجه گیری نمود که پلی آمینها و آنزیمهای وابسته به آنها در کنترل رشد و نمو گیاهی ، اهمیت دارند . به نظر می رسد که ال- آرژانین[34] پیش ساز پوترسین باشد و پلی آمینها می توانند تبدیل متیونین به اتلین را متوقف سازند . این مطلب حاکی از نوعی سیستم کنترلی است که در آن ، اتلین ، آرژنین و پلی آمینها ، نوعی نقش تداخلی[35] را در کنترل سوماتیکی جنین زایی بازی می کنند .
فنیل اوره و مشتقات آن 99
از زمانی که کشف شد [36]DPU فعالیت سیتو کینینی دارد مشخص شد که بسیاری از مشتقات اوره نیز در سیستمهای مختلف آزمون حیاتی[37] فعالیتهای سیتو کینینی اعمال می کنند ( مک و همکاران 1986 ) . برعکس هورگان (1986 ) معتقد است که DPU سیتوکینین اکسیداز را ممانعت می کند ، و ظاهراً باعث افزایش فعالیت سیتوکینینی می شود . در هر صورت مسلم است که ترکیبات بالا خصوصیات خاص خود را نشان می دهند که در این زمینه نیاز به تحقیقات بیشتری می باشد .
به نظر می رسد که فعالیترین ترکیبات پیریدیل اوره و تیدیازول اوره ( تید یازو رون و مشتقات آن) باشند که حدود 10000 برابر از DPU فعالترند و از سیتوکینینهای طبیعی نوع آدنین مثل زاتین هم فعالتر هستند . گزارش شده است که تیدیازورون شاخه دهی را در تعدادی از گونه های چوبی تحریک می کند در حالی که [38]CPPU باعث افزایش زیادی در تعداد شاخه های آزالیای خزان دار می شود ( رید و همکاران 1986 ) .
هیروکرنش (1986 ) نیز دریافتند که تیدیازورون باعث افزایش شاخه در celtis occidentalis می شود . غلظتی در حدود 05/0 تا 1/0 میکرو مولار تیدیازورون فعالتر از 4 تا 10 میکرومولار BA می باشد .
یک مورد جالب در درخت تبریزی مشاهده شده است . روزلی و مک کون (1986 ) نشان دادند که تیدیازورون ( در غلظتی کمتر از 1/0 میکرومولار ) قادر به ایجاد شاخه های ( ساقه های ) نابجا در کالوسهای تبریزی است که کاربرد BA فقط تعدادی شاخه به دست آمد . در هر حال ، جالب توجه است که تشکیل شاخه جانبی در تبریزی ، شدیداً در تمام تیمارهای تیدیازورون متوقف می شود و لازم است که کشتهای مولد شاخه را برای نمو شاخه به محیط فاقد تیدیازورون منتقل کرد .
مخلوط ترکیباتی که منشأ گیاهی دارند
در این مورد ، می توان مواردی را مثل شیرنارگیل ( مایع اندوسپرم نارگیل ) ، آب پرتقال ، آب گوجه فرنگی ف آب انگور ، آب اناناس ، شیره درخت غان ، پورۀ موز ، و غیره نام برد . در عمل استفاده از این مخلوطها در مواقع تحقیقاتی بایستی احتراز شود ، زیرا :
1 – ترکیب آنها ، تقریباً یا کاملاً ناشناخته است .
2 – ترکیب آنها ، خیلی متغیر است به عنوان مثال ، شیر نارگیل ( به صورت رقیق شده 50 تا 150 میلی لیتر در لیتر ) نه تنها بین نارگیلهای جوان و پیر متفاوت است ؛ بلکه حتی بین نارگیلهای همسن نیز تفاوت دارد .
کار با شیر نارگیل ، نتایج شگفت آوری داشته است . استفاده توأم آن با اکسین شدیداً باعث تقسیم سلولی در بافتها شده است ( استوارد 1985 ) . کوو ورد (1962 ) نشان داده سات که شیر نارگیل حاوی ترکیبی شبیه کینتین ( یک سیتو کینین ) است . ستهام ( 1974 ) معتقد است که نارگیلهای رسیده ، حاوی نوعی سیتوکینین بنام نه – بتا – دی – ریبوفورانوزیل زآتین[39] است .
استادان و درویس (1975 ) وجود زآنتین و زآنتین ریبوزید را گزارش کرده اند . بطور کلی اصل مطلب این است که می توان بجای شیرنارگیل ، از سیتوکینین ، استفاده نمود .
ﻫ- شير نارگيل
در كارهاي اوليه اي كه برروي كشت بافت انجام ميشد، شير نارگيل يكي از مواد مهم تشكيل دهنده محيط كشت بود. اين ماده امروزه اهمیت اولیه خود را در کشت بافت از دست داده است ولی هنوز استفاده از ان در محيط غذايي نمونه هایی که بسختی قابل کشت می باشند، ارزش زیادی دارد. در بررسي كه كشت دو رقم ژاپني و هندي.برنج Oryza sativa، توسط دو روش كشت ميكرو (liquid droplet and shallow-layered culture) مقايسه شد، مشخص گرديد كه براي جنين زايي درون شيشه اين گياه بايستي چهارده اسيد امينه و شير نارگيل به محيط كشت افزوده گردد (Zhao et al. 1998). در تحقيقي منتشر نشده كه اخيرا توسط ممقاني و همكاران برروي كالوس زايي يك نوع از درخت نارون (Ulmus parvifolia) انجام شد نيز بيشترين ميزان كالوس در مقايسه با ساير سيتوكينين ها، در محيط كشت حاوي شير نارگيل بدست امد. لذا در حال حاضر نيز در کشت کالوس اغلب گياهان افزودن حدود 10 درصد حجمی و يا بيشتر شیره نارگیل به اغلب محیط های کشت معروف و متداول نتیجه رضایت بخش به همراه دارد. شیره نارگیل ابتدا با سوراخ کردن پوسته سخت ان خارج گردیده و پس از عبور از یک صافی در اتوکلاو استریل و يا بمدت 10 دقيقه جوشانيده می گردد. جهت استفاده بعدی از این ماده بلافاصله بعد از اتوکلاو کردن و زمانی که مایع مذکور هنوز داغ می باشد، در ظروف استریل ریخته شده و در دمای منفی بیست درجه سانتيگراد سرد و نگهداری می شود. در زمان استفاده مجدد، شیره نارگیل یخ زده در حمام اب گرم با دمای 60-70 درجه سانتیگراد ذوب شده و بعد از اتوکلاو کردن محیط کشت به ان اضافه می شود.
مخلوط ترکیبات ازت دار و حاوی ویتامینها 101
از ترکیبات ذیل و نیز اسیدهای آمینه ، به عنوان منابع آلی آزت دار استفاده شده است . هیدرولیزات – کازیین ( 1/0 تا 1 گرم در لیتر ) ، ( پیتون 25/0 تا 3 گرم در لیتر ) ، ( ترپیتون 25/0 تا 2 گرم در لیتر ) و عصاره مالت ( 5/0 تا 1 گرم در لیتر ) . این مخلوطها خیلی پیچیده و حاوی ویتامینها و نیز اسیدهای آمینه هستند . از عصارۀ مخمر (25/0 تا 2 گرم در لیتر ) نیز به علت کیفیت بالای ویتامینهای ب استفاده شده است . شکل 15 – 6 تحریک رشد گیاهچه ارکیده را توسط پیتون و تریپون نشان می دهد .
عصاره مالت[40]
توسط عصاره گیری از محصولات قابل حل از غله خیسانده شده تهیه میشود که درصد ازت کل آن در حدود 1/1 وزنی، آمینو نیتروژن حدود 6/0، کلرید سدیم حدود 1/0 بوده و pHمحلول 1 درصد آن 6/5 میباشد.
در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.
قابل حل در آب میباشد.