برای اندازه گیری های بیشتر، بهتر و دقیقتر می توانید به کتاب مقابل و پایان نامه های گروه زیست شناسی، صنایع غدایی، زراعت و باغبانی مراجعه کنید.

متن کامل این صفحه را از لینک زیر دانلود کنید.

اندازه‌گيري روغن در بذر

براي اندازه‌گيري روغن در بذر از روش وزني استفاده شد. در اين روش يك گرم بذر وزن مي‌گردد و با 18 ميلي‌ليتر محلول ان- هگزان و ايزوپروپانول كه به‌نسبت حجمي 3: 2 با هم مخلوط شده‌اند در يك هاون خرد شده و مخلوط به‌دست آمده توسط كاغذ صافي درون بشري كه از قبل وزن شده بود، صاف گرديد. سپس هاون و دسته هاون با 6 ميلي‌ليتر محلول ان- هگزان و ايزوپروپانول شستشو داده شده و مجددا صاف مي‌گردد. محلول صاف شده پس از تبخير ان-هگزان و ايزوپروپانول توزين مي‌گردد. اختلاف وزن اوليه بشر (بشر خالي) و وزن ثانويه آن مقدار روغن موجود در يگ گرم بذر را نشان مي‌دهد. در نهايت مقدار روغن بر حسب ميلي‌گرم به‌ازاي گرم وزن تر بافت محاسبه گرديد.

نكته مهم: نظر به‌اينكه در اين روش مقدار روغن برآورد شده براي اين گياهان كم بود بنابراين يك مرحله ديگر به روش بالا اضافه شد. بدين‌صورت كه بعد از اين كه بذر در هاون با محلول ان هگزان- ايزوپروپانول خرد شدند مستقيما به لوله‌هاي پلي‌اتيلني منتقل شدند و ديگر عمل صاف‌كردن صورت نگرفت. بعد اين لوله‌ها با دور 1000 به‌مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ شدند و بعد از سانتريفيوژ فاز بالايي به داخل بشر از قبل وزن شده ريخته شد و عمل تبخير صورت گرفت و دوباره بشر وزن شد كه اختلاف وزن درصد روغن مي‌باشد.

نكته: در مواردي كه در عصاره الكلي رنگيزه وجود دارد براي حذف رنگيزه از سولفات‌سديم استفاده مي‌شود. بدين‌صورت كه 2 گرم از اين ماده در 30 ميلي‌ليتر آب مقطر حل مي‌گردد. بعد از آن به‌ازاي هر 24 ميلي‌ليتر عصاره الكلي 12 ميلي‌ليتر از اين ماده اضافه مي‌شود و در قيف جداكننده ريخته مي‌شود. بعد در قيف محكم مي‌شود و براي يك دقيقه تكان داده مي‌شود. در حين كار سر قيف به‌طرف بالا نگهداشته مي‌شود و آرام انتهاي آن باز مي‌شود تا گاز تشكيل شده خارج مي‌شود اين عمل چندين بار انجام مي‌شود. بعد از يك دقيقه، سر قيف برداشته مي‌شود. رنگيزه‌ها در انتهاي قيف با سولفات‌سديم ته‌نشين مي‌گردد كه با بازكردن دهانه قيف به‌آرامي از فاز الكلي جدا مي‌گردد. ادامه كار مثل بالا است.

استخراج و اندازه‌گيري قندهاي محلول

استخراج قندهاي محلول

استخراج قندهاي محلول با استفاده از روش اوموكولو (1996) انجام شد. در اين روش 40 ميلي‌گرم از بقاياي بافتي (بذري) به‌جا مانده پس از استخراج روغن در لوله‌هاي پلي‌اتيلني (لوله‌هاي سانتريفيوژ) با 5 ميلي‌ليتر اتانول 80 درصد مخلوط و به‌مدت 10 دقيقه در حمام آب گرم (بن‌ماري) با دماي 70 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت. عصاره‌هاي الكلي به‌دست آمده به‌مدت 15 دقيقه با دور 1000g سانتريفيوژ گرديد و محلول شفاف به‌دست آمده حاوي قندهاي محلول به يك بشر منتقل شد و عمل فوق 4 مرتبه ديگر بر روي بقاياي بافتي به‌جا مانده تكرار گرديد. در نهايت عصاره الكلي با حرارت تغليظ شده و حجم آن به يك‌پنجم اوليه رسيد و از آن براي اندازه‌گيري انواع قندهاي محلول استفاده شد.

نكته: برخي اوقات در برخي از گياهان غير‌روغني، مي‌توان مستقيما از بذر نمونه رفت بدين‌صورت كه براي مثال 5/0 گرم بذر وزن و مراحل استخراج قندهاي محلول درست مثل بالا انجام مي‌شود و عصاره الكلي به‌دست آمده تبخير مي‌شود تا زماني كه به يك‌پنجم مقدار اوليه خود برسد.

نكته: برخي اوقات در هنگام تبخير مقدار عصاره الكلي كمتر از 5 ميلي‌ليتر مي‌شود (براي مثال 4 ميلي‌ليتر) در اين هنگام مي‌توان مقدار كم شده را با آب تكميل كرد (يعني يك ميلي‌ليتر آب اضافه مي‌شود) و اندازه‌گيري‌هاي بعدي بر روي اين عصاره الكلي انجام مي‌شود.

نكته: برخي اوقات در عصاره الكلي قندي رنگيزه وارد مي‌شود كه براي رنگ‌زدايي از پودر زغال استفاده مي‌شود. بدين‌صورت كه به‌ازاي هر 20 ميلي‌ليتر از عصاره قندي، 200 ميلي‌گرم پودر زغال اضافه مي‌شود و در g4000 به‌مدت 15 دقيقه سانتريفيوژ مي‌شود.

اندازه‌گيري قند كل

اندازه‌گيري قند كل به‌ روش مک‌کريدي و همکاران (1950) انجام گرديد. براي اندازه‌گيري قند كل 2/0 ميلي‌ليتر (200 ميكروليتر) از عصاره تغليظ شده با 3 ميلي‌ليتر آنترون مخلوط و به‌مدت 20 دقيقه در حمام آب گرم با دماي 100 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت. ميزان جذب نور هر يك از نمونه‌ها پس از سردشدن در طول موج 620 نانومتر اندازه‌گيري شد.

قبل از اندازه‌گيري قند كل نمونه، ابتدا بايد منحني استاندارد قند كل رسم گردد كه براي رسم آن از محلول گلوگز 1 ميلي‌گرم در 1 ميلي‌ليتر آب استفاده شد. لازم به ذكر است كه براي آنكه دقت اندازه‌گيري بيشتر گردد مي‌توان 5 ميلي‌گرم گلوگز را با 5 ميلي‌ليتر آب مخلوط كرد و استفاده كرد. پس از تهيه محلول گلوگز، در لوله‌هاي آزمايش شيشه‌اي مقادير 0، 20، 40، 60، 80 و 100 ميكروليتر از محلول فوق كه به‌ترتيب حاوي 0، 20، 40، 60، 80 و 100 ميكروگرم گلوگز بود، اضافه گرديد. در نهايت حجم محلول‌ها با آب مقطر به 200 ميكروليتر رسانده شد. لوله آزمايشي كه فاقد گلوگز بود به‌عنوان شاهد استفاده شد (بلانك). پس از آن 3 ميلي‌ليتر آنترون به هر كدام از لوله‌هاي آزمايش اضافه شد و پس از اضافه كردن، لوله‌هاي آزمايش به‌مدت 20 دقيقه در حمام آب گرم با دماي 100 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت و پس از سرد شدن در طول موج 620 نانومتر قرائت گرديد ( جدول و شكل زير).

نكته: براي تهيه 100 ميلي‌ليتر معرف آنترون، ابتدا 76 ميلي‌ليتر اسيدسولفوريك 98 درصد با 30 ميلي‌ليتر آب رقيق شد. بعد از سرد شدن 150 ميلي‌گرم آنترون در آن حل گرديد و در ظرف كهربايي نگهداري شد.

نكته: لازم به ذكر است كه اسيد بايد كم كم در آب ريخته شود و آب در اسيد ريخته نشود زيرا احتمال خطر وجود دارد.

جدول2. طرز تهيه نمودار استاندارد قندهاي محلول

نكته: لازم به ذكر است كه وقتي نمونه اصلي پس از اعمال تيمار با اسپكتوفتومتر خوانده مي‌شود عدد خوانده شده بايد در رنج اعداد منحني استاندارد باشد و اگر بالاتر از اعداد منحني استاندارد بود بايد به‌جاي 2/0 ميلي‌ليتر، 1/0 ميلي‌ليتر از عصاره الكلي برداشته شود و به آن 1/0 سي‌سي آب اضافه گردد و بعد مراحل بعدي ادامه پيدا كند.

اندازه‌گيري قنداي احيايي

قندهاي احيايي به روش ميلر (1959) اندازه‌گيري شدند. براي اندازه‌گيري قندهاي احيايي 5/1 ميلي‌ليتر از عصاره تغليظ شده حاوي قندهاي محلول با 5/1 ميلي‌ليتر از معرف دي‌نيتروساليسيليك اسيد مخلوط شده و به‌مدت 20 دقيقه در حمام آب گرم در دماي 90 درجه‌ سانتي‌گراد قرار گرفت. پس از آن بلافاصله 5/0 ميلي‌ليتر پتاسيم سديم تارتارات %40 به آن افزوده و پس از سرد شدن لوله‌ها جذب نور آنها در طول موج 575 نانومتر خوانده شد.

براي تهيه منحني استاندارد از محلول گلوگز با غلظت 1 ميلي‌گرم در ميلي‌ليتر استفاده شد. به هر يك از لوله‌هاي آزمايش، مقادير 0، 100، 150، 200، 400، 600، 800، و 1000 ميكروليتر از محلول گوكز كه به ترتيب حاوي 0، 100، 150، 200، 400، 600، 800، و 1000 ميكروگرم گلوكز بودند، اضافه گرديد. در نهايت حم لوله‌هاي آزمايش توسط آب مقطر به 5/1 ميلي‌ليتر رسانده شد. لوله‌هاي آزمايشي كه فاقد گلوكز بود، به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شد. پس از انجام مراحل ذكر شده در بالا ميزان جذب نور در طول موج 575 نانومتر خوانده شد و با استفاده از آن منحني استاندار رسم گرديد (شكل 2-2).

نكته: براي تهيه 100 ميلي‌ليتر معرف دي‌نيترو ساليسيليك اسيد، 1 گرم هيدروكسيد سديم را در آب مقطر حل كرده و سپس 05/0 گرم سولفيت سديم (Na₂SO₃) به آن اضافه مي‌گردد. در ظرف ديگري 1 گرم دي‌نيترو ساليسيليك اسيد را با 2/0 گرم فنل در آب مقطر حل كرده و به محول اول اضافه مي‌شود و با آب مقطر به جم نهايي 100 ميلي‌ليتر مي‌رسد.

جدول 2-2- طرز تهيه نمودار استاندارد قندهاي احيايي به روش ميلر (1959)

اندازه‌گيري فروكتوز

اندازه‌گيري فروكتوز با استفاده از روش اشول (1957) انجام گرديد. بدين منظور به 2 ميلي‌ليتر از عصاره الكلي تغليظ شده، 1 ميلي‌ليتر معرف ري‌سورسينول اضافه نموده، سپس 7 ميلي‌ليتر اسيد كلريدريك رقيق به آن اضافه مي‌كنيم. لوله‌ها را در حمام آب گرم با دماي 80 درجه سانتي‌گراد به مدت 10 قرار داده و پس از آن، آنها را به ‌مدت 5 دقيقه در آب شير غوطه‌ور ساخته تا خنك شوند. سپس جذب محلول رنگي هر يک از نمونه‌ها در طول موج 520 نانومتر در فاصله 30 دقيقه قرائت شد.

قبل از اندازه‌گيري فروكتوز، ابتدا بايد منحني استاندارد فروكتوز رسم گردد كه براي رسم آن 5 ميلي‌گرم فروكتوز را در 50 ميلي‌ليتر آب مقطر حل مي‌كنيم. لازم به ذكر است كه براي آنكه دقت اندازه‌گيري بيشتر گردد مي‌توان 5 ميلي‌ليتر از اين محلول مادر را تا حجم 50 ميلي‌ليتر مقطر رقيق و استفاده كرد. پس از تهيه محلول فروكتوز، در لوله‌هاي آزمايش شيشه‌اي مقادير 0، 2/0، 4/0، 6/0،8/0 و 1 ميلي‌ليتر از محلول استاندارد، اضافه گرديد. در نهايت حجم محلول‌ها با آب مقطر به 2 ميلي‌ليتر رسانده شد. لوله آزمايشي كه فاقد فروكتوز بود به‌عنوان شاهد استفاده شد (بلانك). پس از آن 1 ميلي‌ليتر معرف ري‌سورسينول و 7 ميلي‌ليتر اسيد كلريدريك رقيق به هر كدام از لوله‌هاي آزمايش به‌ترتيب اضافه شد و پس از اضافه كردن، لوله‌هاي آزمايش به‌مدت 10 دقيقه در حمام آب گرم با دماي 80 درجه سانتي‌گراد قرار گرفتند و سپس لوله‌هاي آزمايش را ‌به‌مدت 5 دقيقه در آب شير غوطه‌ور كرده تا خنك شوند. بعد از آن جذب محلول رنگي هر يک از نمونه‌ها در طول موج 520 نانومتر در فاصله 30 دقيقه قرائت گرديد ( جدول و شكل زير).

جدول2. طرز تهيه نمودار استاندارد قند فروكتوز

اندازه‌گيري قندهاي غيراحيايي

قندهاي غيراحيايي به روش هاندل (1968) اندازه‌گيري شدند. بدين منظور 1/0 ميلي‌ليتر از عصاره الکلي تغليظ شده با 1/0 ميلي‌ليتر هيدروکسيد پتاسيم 30 درصد مخلوط شده و به‌مدت 10 دقيقه در بن‌ماري در دماي 100 درجه سانتي‌گراد قرار داده شد. پس از سر‌دشدن لوله‌ها، 3 ميلي‌ليتر معرف آنترون به آن افزوده و به‌مدت 20 دقيقه در بن‌ماري با دماي 40 درجه سانتي‌گراد قرار گرفتند. سپس جذب نور هر يک از نمونه‌ها در طول موج 620 نانومتر قرائت شد. در نهايت با توجه به فرمول به‌دست آمده از نمودار استاندارد و جذب نور در نمونه‌ها ميزان قند غيراحيايي به‌دست مي‌آيد.

تهيه نمودار استاندارد قندهاي غيراحيايي

براي تهيه نمودار استاندارد از محلول ساکارز با غلظت يک ميلي‌گرم در ميلي‌ليتر آب مقطر استفاده شد. به هر لوله آزمايش، مقادير 0، 20، 40، 60، 80، 100 ميکروليتر از محلول پايه ساکارز که به‌ترتيب حاوي 0، 20، 40، 60، 80، 100 ميکروگرم ساکارز بودند، اضافه گرديد. در نهايت حجم لوله‌هاي آزمايش با آب مقطر به 100 ميکروليتر رسانده شد. لوله آزمايشي که فاقد ساکارز بود، به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شد. سپس به مخلوط حاصل 1/0 ميلي‌ليتر محلول هيدروکسيد پتاسيم 30 درصد اضافه و به‌مدت 10 دقيقه در بن‌ماري در دماي 100 درجه سانتي‌گراد قرار داده شد. پس از سردشدن لوله‌ها، 3 ميلي‌ليتر معرف آنترون به آن افزوده و به‌مدت 20 دقيقه در بن‌ماري با دماي 40 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت. پس از سرد شدن لوله‌ها، جذب نور در طول موج 620 نانومتر قرائت و نمودار استاندارد قندهاي غيراحيايي رسم گردي

دجدول طرز تهيه نمودار استاندارد قندهاي غير احيايي

استاندار قندهاي غير احيايي

نکات

محلول پس از اضافه شدن معرف آنترون زرد و پس از حمام سبز رنگ شد.

نمونه ي شاهد زرد رنگ باقي ماند.

دقت شود در اين کار وسايل مورد استفاده شده کاملا تميز و خشک باشند.

استخراج و اندازه‌گيري نشاسته

استخراج نشاسته

استخراج نشاسته با روش مک‌کريدي و همکاران (1950) صورت گرفت. در اين روش 40 ميلي‌گرم از بقاياي بافتي به‌جا مانده عاري از روغن و قندهاي محلول را در ميکروتيوب ريخته و 2/0 ميلي‌ليتر آب مقطر به آن افزوده و در يخ نگهداري شد و بلافاصله به آن 26/0 ميلي‌ليتر اسيد پرکلريک 52 درصد افزوده و به‌مدت 15 دقيقه در يخ نگهداري شد. پس از گذشت اين مدت، 4/0 ميلي‌ليتر آب مقطر به آن افزوده و به‌مدت 10 دقيقه با سرعت g 5800 سانتريفيوژ گرديد. پس ازسانتريفيوژ، فاز بالايي به درون لوله آزمايش منتقل شد و در يخ نگهداري گرديد .رسوبات باقي مانده نيز با 1/0 ميلي‌ليتر آب مقطر و 13/0 ميلي‌ليتر اسيد پركلريك 52 درصد مجددا استخراج و پس ازسانتريفيوژ، فاز بالايي آن به لوله اول منتقل شد و در نهايت حجم فاز محلول درون لوله آزمايش با آب مقطر به 2 ميلي‌ليتر رسانده شد و از آن براي اندازه‌گيري نشاسته استفاده شد.

اندازه‌گيري نشاسته

براي اندازه‌گيري نشاسته از روش مک‌کريدي و همکاران (1950) استفاده شد. در اين روش، 2/0 ميلي‌ليتر از عصاره حاوي نشاسته با 3 ميلي‌ليتر از معرف آنترون مخلوط و به‌مدت 20 دقيقه در دماي 100 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت. پس از سرد شدن لوله‌ها جذب نور نمونه‌ها در طول موج 620 نانومتر قرائت شد.

براي تهيه نمودار استاندارد از محلول نشاسته با غلظت 1 ميلي‌گرم در 1 ميلي‌ليتر استفده شد. در لوله‌هاي آزمايش، مقادير 5، 20، 40، 60، 80 و 100 ميكروگرم نشاسته بودند اضافه گرديد. در نهايت حجم لوله‌ها با آب مقطر به 2/0 ميلي‌ليتر رسيد و لوله‌ آزمايشي كه فاقد نشاسته بود به‌عوان شاه در نظر گرفته شد. سپس مطابق روشي كه در بالا ذكر گرديد كمپلكس رنگي توليد و ميزان جذب نور در طول موج 620 نانومتر اندازه‌گيري شد و نمودار استاندارد رسم گرديد.

نكته: براي تهيه 100 ميلي‌ليتر معرف آنترون، ابتدا 76 ميلي‌ليتر اسيدسولفوريك 98 درصد با 30 ميلي‌ليتر آب رقيق شد. بعد از سرد شدن 150 ميلي‌گرم آنترون در آن حل گرديد و در ظرف كهربايي نگهداري شد.

نكته: لازم به ذكر است كه اسيد بايد كم كم در آب ريخته شود و آب در اسيد ريخته نشود زيرا احتمال خطر وجود دارد.

طرز تهيه نمودار استاندارد نشاسته به روش مک‌کريدي و همکاران (1950)

تعيين غلظت کلروفيل a ، b و کل با روش آرنون

ابتدا 100 ميلي‌گرم از بافت تر گياه در داخل هاون چيني با 10 ميلي‌ليتر استن 80 درصد ساييده شد. سپس محلول حاصل به لوله‌هاي سانتريفوژ انتقال و بقاياي موجود در هاون، با مقداري استن 80 درصد شسته و به محلول درون لوله اضافه گرديد. سپس لوله‌ها به‌مدت 10 دقيقه در rpm 6000 سانتريفوژ شدند. محلول فوقاني به بالن ژوژه 25 ميلي‌ليتري انتقال يافته و حجم آن توسط استن 80 درصد به 25 ميلي‌ليتر رسيد. اندازه‌گيري کلروفيل با روش اسپکتروفتومتري با دستگاه اسپکتروفتومتر شيمادزو مدل (Shimadzu UV-160) انجام گرفت. به اين ترتيب که مقدار جذب محلول‌ها را در طول موج 645 و 663 نانومتر خوانده و مقدار کلروفيل a، b و کل بر اساس روابط زير محاسبه گرديد:

Chl.a mg/g FW=[ 7/12 ‌( A663) – 69/2 (A 645)] × V/W

Chl.b mg/g FW=[ 9/22 ‌( A645) – 68/4 (A 663)] × V/W

Chl. total mg/g FW=[ 2/20 ‌( A645) + 02/8 (A 663)] × V/W

663A و 645A به ترتيب عبارتند از مقدار جذب خوانده شده در طول موج 663 و 645 نانومتر، V حجم نهايي استن مصرفي بر حسب ميلي‌ليتر و W وزن بافت تر است.

استخراج اجسام روغني و اندازه‌گيري آتوليز آن‌ها با روش اسپکتروفتومتري

استخراج اجسام روغني از روش صادقي‌پور و باهاتلا (2002) انجام شد. ابتدا 2 گرم بافت لپه با 6 ميلي‌ليتر بافر استخراج شامل تريس بازي 1/0 مولار با اسيديته 5/7، ساکاروز 4/0 مولار، کلريد پتاسيم 10 ميلي‌مولار، سولفات‌منيزيم 1 ميلي‌مولار، اتيلن دي آمين تترا استيک اسيد (ETDA) 1 ميلي‌مولار، فنيل متيل سولفونيل‌فلورايد (PMSF) 1 ميلي‌مولار، پلي ونيل پلي پيروليدون (PVPP) 6/0 درصد و 2- مرکاپتواتانل 50 ميلي‌مولار در اون سرد خرد و هموژنيزه گرديد. سپس عصاره حاصل پس از صاف شدن توسط دو لايه پارچه ململ، به‌مدت 15 دقيقه در g × 5800 سانتريفوژ شد و فاز رويين روغني براي اندازه‌گيري فعاليت آنزيم ليپاز به‌کار رفت.

اندازه‌گيري فعاليت آنزيم ليپاز

فعاليت آنزيم ليپاز به روش صادقي‌پور و باهاتلا (2002) انجام گرديد. در اين روش فاز رويين روغني برداشت شده پس از سانتريفوژ در 2 ميلي‌ليتر بافر تريس 20 ميلي مولار با اسيديته 5/7 حاوي ساکاروز 2/0 مولار به‌طور کامل هموژن گرديد. سپس 1/0 ميلي‌ليتر از مخلوط حاصل با 9/0 ميلي‌ليتر بافر استات سديم 1/0 مولار با اسديته 5/4، بافر تريس 1/0 مولار با اسديته 5/7 و 9 مخلوط گرديد و در حمام آب گرم با دماي ^°C 35 نگهداري شد و در فواصل ده دقيقه‌اي به‌مدت يک ساعت، هر بار 1/0 ميلي‌ليتر از مخلوط واکنش برداشت شد و در دماي ^°C 90 فعاليت آنزيمي متوقف گرديد. ميزان اسيدچرب آزاد شده در مخلوط واکنش به روش اسپکتروفتومتري (1969) Chakrabarty et al. اندازه‌‌گيري شد. مقادير برداشت شده از زمان‌هاي مختلف با 1 ميلي‌ليتر بنزن با استفاده از ورتکس مخلوط گرديد تا اسيدهاي‌چرب آزاد شده در فاز بنزني استخراج شوند. پس از سانتريفوژ به‌مدت 5 دقيقه در g × 1000، مقدار 4/0 ميلي‌ليتر از فاز بنزني برداشت شد و با 6/1 ميلي‌ليتر بنزن مخلوط گرديد و در نهايت 1 ميلي‌ليتر معرف رودآمين 6G به آن افزوده شد. پس از گذشت 30 دقيقه جذب نور در طول موج 535 نانومتر اندازه‌گيري شد.

براي تهيه نمودار استاندارد اسيد‌چرب به لوله‌هاي آزمايش 100 × 12 ميلي‌متري مقادير 0، 40، 80، 120، 160، 200، 240 و 280 ميکرومتر از محلول اسيد استئاريک در بنزن که به‌ترتيب حاوي 0، 80، 160، 240، 320، 400، 480 و 560 نانومول اسيدچرب بودند، منتقل گرديد. در نهايت حجم لوله‌هاي آزمايش با محلول بنزن به 1 ميلي‌ليتر رسانده شد. لوله آزمايشي که فاقد اسيد استئاريک بود به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شد. سپس 5/0 ميلي‌ليتر معرف رودآمين 6G به آن افزوده شد و جذب نور آن‌ها در طول موج 535 نانومتر به دست آمد (جدول2-5). در نهايت با استفاده از مقادير جذب نور بدست آمده نمودار استاندارد اسيدچرب رسم گرديد.

براي تهيه معرف رودآمين ابتدا 25 ميلي‌گرم رود‌آمين 6G در 25 ميلي‌ليتر بافر فسفات (KH₂PO₄) 2/0 مولار با اسيديته 7/9 و سود (NaOH) 2/0 مولار حل شد. سپس محلول حاصل با 500 ميلي‌ليتر بنزن در يک قيف جدا کننده (دکانتور) استخراج گرديد. در نهايت فاز آبي دور ريخته شد و فاز بنزني نارنجي رنگ به‌ ظرف کهربايي منتقل شده و پس از افزودن اندکي سود در تاريکي نگهداري گرديد.

طرز تهيه نمودار استاندارد اسيدچرب به روش (1969) Chakrabarty et al

آنتوسيانين

براي تهيه نمونه آنتوسيانين، 1 گرم از بافت له شده در لوله آزمايش ريخته و دور لوله آزمايش را با كاغذ آلومينيومي پوشانده شد. سپس اسيد و الك با نسبت الكل 96 درصد (99 ميلي‌ليتر) و يك ميلي‌ليتر اسيد كلريدريك به آن اضافه شد و پس از نگهداري در يخچال به‌مدت 24 ساعت، صاف شد و ميزان جذب آنتوسيانين در طول موج 512 نانومتر قرائت شد. براي شاهد يا بلانك هم از اسيد + الكل به نسبت ذكر شده استفاده گرديد.

منبع: بررسي تاثير برش غده و تيمار با اتيلن بر تعداد و طول جوانه‌ها و تغييرات ميزان آنتوسيانين، آميلاز و محتواي كلروفيلي غده‌هاي سيب‌زميني. كامبيز مشايخي، بهنام كامكار و رضوان خسروي

اندازه‌گيري آلفاآميلاز

ابتدا يك گرم از بافت تر گياه با 20 ميلي‌ليتر بافر فسفات 10 ميلي‌مولار با 2/7=pH که حاوي 50 ميلي‌مولار NaCl مي‌باشد در دماي اتاق در داخل هاون چيني ساييده شد. سپس محلول حاصل به لوله‌‌ سانتريفوژ انتقال داده شد. به‌مدت 24 ساعت لوله حاوي نمونه‌ روي شيکر هم‌زده شد. سپس لوله‌ به‌مدت 35 دقيقه در rpm 2000 سانتريفوژ شد. پس ازسانتريفيوژ، فاز بالايي به درون لوله آزمايش منتقل شد و رسوبات باقي‌مانده نيز با افزودن 10 سي‌سي ماده فوق به‌مدت 2 ساعت روي شيکر قرار داده و پس از سانتريفيوژ، فاز بالايي آن به لوله اول منتقل شد. در صورت انجام نشدن آزمايش در همان روز در دماي 20- درجه سانتي‌گراد نگهداري مي‌شود. بعد از آن نيم ميلي‌ليتر آنزيم داخل محلول بافر به‌علاوه نيم ميلي‌ليتر محلول نشاسته 1 درصد مخوط شده و به‌مدت 15 دقيقه در دماي 100 درجه سانتي‌گراد قرار داده شد. بعد به‌مدت 3 دقيقه در دماي 37 درجه سانتي‌گراد قرار داده و سپس واکنش با افزودن 3 ميلي‌ليتر معرف دي نيترو ساليسيليک اسيد متوقف گرديده و به‌مدت 5 دقيقه در بن‌ماري در دماي جوش قرارداده، بعد لوله‌ها را سرد کرده و 1 ميلي‌ليتر تارتارات سديم پتاسيم اضافه کرده و مقدار فعاليت آنزيم با طول موج 510 نانومتر قرائت مي‌شود.

استخراج عصاره از برگ گیاه

ابتدا برگ‌ها در محیط آزمایشگاه و در دمای طبیعی خشک شده سپس در آسياب به‌صورت پودر در آمدند. نمونه­های پودر شده وزن شده و مقدار 5 گرم از پودر نمونه در ارلن 50 میلی‌لیتری ریخته شد و سپس به آن 50 سی‌سی متانول 80 درصد اضافه شد (نسبت نمونه به محلول متانولی 1به 10 باید باشد). پس از 24 ساعت با استفاده از کاغذ صافی محلول متانولی حاوی نمونه صاف شد. پس از آن محلول متانولي را به دستگاه روتاري براي خارج كردن متانول از عصاره انتقال دادیم. پس از تبخیر متانول در دستگاه، عصاره خالص در ظرف كوچكي ريخته شد و براي اندازه‌گيري فنل ، فلاوونوئيد و فعاليت آنتي اكسيداني استفاده شد.

اندازه‌گیری آنتی اکسیدانت به روش DPPH

میزان مهار رادیکال­های دی پی پی اچ (DPPH)، با روش ابراهیم‌زاده و همکاران (2008) مورد ارزیابی قرار گرفت. ابتدا از عصاره بالا 40 ميلي‌گرم وزن نموده در 25 سي‌سي متانول حل کردیم. وزن مورد نظر را برداشته در مقدار كمي متانول حل کرده سپس به حجم 25 سي‌سي با متانول رساندیم. چون عصاره چسبناك است و وزن كردن آن سخت است پس اول بالن 25 سي‌سي روي ترازو صفر كرديم و نمونه را در آن مي ريزيم. دقت ترازو براي اين كار بايد تا 4 رقم اعشار باشد.

در اين مرحله راديكال پايدار دي فنيل پيكريل هيدرازيل يا DPPH را به غلظت 4 ميلي‌گرم در 100 سي‌سي متانول حل مي‌كنيم (0.1 میلی مولار). سپس براي هر عصاره 5 غلظت بايد ساخته شود. برای این منظور، محلول­هائی با غلظت­های 500-5/12 میکرو­گرم در میلی­لیتر از تمامی عصاره­ها در حلال متانول آماده شدند. پس 5 لوله انتخاب مي‌كنيم. ابتدا در همه لوله‌ها 2 سي‌سي DPPH مي‌ريزيم. سپس 2 سی‌سی عصاره به DPPH اضافه می‌کنیم. پس 5 لوله با غلظت‌های متفاوت عصاره و DPPH یکسان داریم. بعد از اين كار لوله‌ها به‌مدت 15 دقيقه در محيط تاريك قرار مي‌گيرد و در طول موج 517 نانومتر خوانده مي­شوند. علاوه بر لوله‌هاي مذكور يك لوله براي شاهد در نظر مي‌گيريم اين لوله ماكزيمم جذب را دارد و فقط 2سي‌سي DPPH و 2 سی‌سی متانول دارد. اسپكت بايد با متانول صفر شود.

معمولا رنگ لوله‌ها در جهت افزايش غلظت از ارغواني به زرد است. يعني غليظ‌ترين لوله كه بيشترين عصاره را دارد زرد است و كمترين غلظت ارغواني است و مربوط بهDPPH است. اعداد زير توسط فرمول زير به درصد مهار تبديل مي­شود: عدد جذب نمونه را از عدد شاهد كم كرده و بر عدد شاهد تقسيم مي‌كنيم بنابراين براي هر جذب يك درصد مهار داريم (از هر نمونه 5 غلظت خوانده شد پس 5 درصد مهار داريم). در انتها 5 عدد به‌دست آمده در اكسل تشكيل يك شيب خط را مي­دهد. از فرمول به‌دست آمده يا همان شيب خط بدست آمده y درصد جذب مهار است و X غلظت بوده و مجهول ما مي­باشد.

= درصد مهار رادیکال‌های آزاد (DPPH)

با به‌دست آمدن اين خط براحتي مي‌توان محاسبه كرد كه اگر درصد مهار ما 50 باشد غلظت چقدر است به اين عدد IC₅₀ گويند. در واقع IC₅₀ غلظتي را نشان مي‌دهد كه در آن درصد مهار 50% است و واحد آن ميلي‌گرم بر ميلي‌ليتر است. IC₅₀ را توسط ماشين حساب مي­توان حساب كرد X ها و Yها را به دستگاه داده و در نهايت با دادن عدد 50 بجاي y ، مي توان x را حساب كرد. در مقاله ميانگين غلظت مهار 50% IC50 در عصاره متانولي بر اساس ميلي‌گرم بر ميلي‌ليتر گزارش مي‌شود.

باید دقت کرد که 5 عدد به‌دست آمده برای درصد مهار به گونه‌ای باشد که عدد 50 (نه لزوما عدد 50) را هم شامل شود، به‌عنوان مثال در جدول بالا بین اعداد 38.7 و 62.4 عدد 50 هم وجود دارد، در حالیکه اعداد 79،83،94،95،99 دارای محدوده نادرستی می‌باشند. علت این امر بالا بودن غلظت عصاره است، بدین منظور باید یک نمونه جهت تست نمودن که دارای محدوده وسیعی از غلظت بالا تا پایین باشد (12.5 تا1000 میکروگرم بر میلی‌لیتر) تا غلظت‌های مناسب جهت به‌دست آوردن درصد مهار بدست آید. در صورتی که از اعداد با محدوده بالا تر از 50 استفاده شود، IC₅₀ به‌دست آمده از این معادله خط منفی می‌شود، که نادرست است.

اندازه‌گیری فنل کل

اندازه‌گیری فنل کل از روش ابراهیم‌زاده و همکاران (2008) انجام شد. تهيه عصاره به روش قبلي است. بعد از گرفتن عصاره 0.5 سي‌سي عصاره متانولي (40 ميلي‌گرم در 25 سي‌سي) را با 5 سي‌سي فولين سيوكالتيو (1 به 10 رقيق شده با آب مقطر) مخلوط مي‌كنيم سپس 4 سي‌سي كربنات‌سديم يك مولار (10.6 گرم در 100 سي‌سي آب مقطر) اضافه مي‌كنيم. براي شاهد نيز بجاي عصاره خشك، متانول كه حلال است ريخته مي‌شود و بعد فولين سيوكالتيو و كربنات‌سدیم اضافه مي‌گردد. از اين محلول براي صفر كردن اسپكتروفتومتر استفاده مي‌شود. محلول فوق بايد 15 دقيقه در تاريكي قرار گيرد و بعد در طول موج 765 نانومتر خوانده شود. عصاره متانولي را مي‌توان كمتر درست كرد مثلا 40 ميلي‌گرم در 25 سي‌سي متانول. با استفاده از استاندارد گالیک اسید منحنی کالیبراسیون رسم می‌شود. معادله‌ای که به‌دست می‌آید مشابه معادله y=0.0063X است.

در اينجا y همان عددي است كه در مقابل بلانك خوانده مي‌شود از اين طريق x به‌دست مي‌آيد. چون غلظت عصاره 40 ميلي‌گرم عصاره خشك در 80 سي‌سي و يا به‌عبارت ديگر 1600 ميلي‌گرم در ليتر يا 1.6 گرم در ليتر بوده است. بايد اين x را براي 1 گرم در ليتر حساب كرد. كه در اينجا x دوم به‌دست آمده به‌عنوان محتواي فنلي و بر حسب اكي‌والان گاليك اسيد در يك گرم عصاره خشك به‌دست مي‌آيد.

اندازه‌گيري محتواي فلاونوئيد

تهيه عصاره خشك به روش قبلي است. 0.5 سي‌سي از عصاره متانولي+ 1.5 سي‌سي متانول+ 0.1 سي‌سي آلومنيوم كلريد10% در اتانول(10 گرم الومنيوم كلريد در 100 سي‌سي اتانول و آب مقطر)+ 0.1 سي‌سي استات‌پتاسيم يك مولار (2.41 گرم در 10 سي‌سي آب مقطر)+ 2.8 سي‌سي آب مقطر. براي تهيه شاهد نيز بجاي عصاره متانولي، متانول خالص مي‌ريزيم. سپس مخلوط در نيم ساعت تاريكي قرار گرفته و در طول موج 415 نانو متر خوانده مي‌شود. اعداد به‌دست آمده براي فنل و فلاونوئيد بايد با رجوع به منحني استاندارد تبديل به‌ميزان واقعي شوند. براي اين كار بدين صورت عمل مي‌شود. به‌عنوان مثال اگر معادله منحنی استاندارد ما y= 0.0067x+0.0132 باشد،

Y همان جذب خوانده شده توسط بلانك است. در اينجا x را به‌دست آورده و سپس در يك تناسب براي 1 گرم در ليتر عصاره محاسبه مي‌شود و بر اساس اکی‌والان کوئرستین در یک گرم عصاره خشک گزارش می‌شود.

اندازه‌گیری کلروژنیک اسید و کافئیک اسید با استفاده از دستگاه HPLC

به‌منظور اندازه گیری کلروژنیک و کافئیک اسید از کروماتوگرافی با کارایی بالا استفاده شد. HPLC یعنی کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد یا کروماتوگرافی مایع با کارکرد عالی است. HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. که فاز ثابت ممکن است جامد و یا مایع باشد و فاز متحرک مایع است.

مدل دستگاه استفاده شده مرک- هیتاچی است. که شامل تجهیزات زیر می‌باشد:

- پمپ : لاکروم

- مدل ل- 7100

- دتکتور : UV

- ستون : C-18 با ابعاد 6/4 × 250 میلی متر

- اندازه ذرات : 5 میکرومتر

نمونه‌ها با سرعت جریان یک میلی‌متر در دقیقه در طول موج 280 نانومتر اندازه‌گیری شدند. فاز متحرک شامل استونیتریل به میزان 10 میلی‌لیتر به اضافه 1 میلی لیتر اسیداستیک و 89 میلی‌لیتر آب مقطر دیونیزه می‌باشد.

آماده‌سازی نمونه

برای آماده‌سازی نمونه جهت تزریق به دستگاه HPLC ، ابتدا نمونه به‌مدت 48 ساعت در آون با دمای 38 درجه سانتی‌گراد خشک شده و سپس آسیاب شد. 50 میلی‌گرم از نمونه پودر شده به ارلن مایر 50 میلی‌لیتری حاوی 5/12 میلی‌لیتر ترکیب متانول و آب به نسبت 80 به 20 (v/v) اضافه شد سپس30 دقیقه در التراسوند قرار داده شده و پس از آن آب دو بار تقطیر به‌نسبت 1:1 به عصاره اضافه گردید (12.5 میلی‌لیتر آب دو بار تقطیر اضافه شد). محلول حاصله به‌مدت 15 دقیقه در دور 5000 تا 6000 سانترفیوژ شد. بخش فوقانی محلول سانترفیوژ شده به ظروف مخصوص HPLC انتقال داده شد و در دمای 18- درجه تا زمان آنالیز نگه‌داری شدند (شوتز و همکاران 2006).

تهیه نمودار کالیبراسیون برای کلروژنیک اسید و کافئیک اسید

به‌منظور تهیه منحنی کالیبراسیون و معادله خط مربوطه از غلظت‌های 500، 250، 100، 50، 20 و 10 میلی‌گرم بر لیتر کلروژنیک اسید و کافئیک اسید استفاده گردید. به این صورت ابتدا یک محلول پایه از کلروژنیک و کافئیک اسید با غلظت 500 میلی‌گرم بر لیتر تهیه و سپس حجم معینی از آن را درون بالن ژوژه 10 سی‌سی، توسط متانول خالص رقیق نموده تا هر یک از غلظت‌های فوق حاصل گردد. هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل به‌دست آمد.

تزریق نمونه گیاهی

به‌منظور شناسایی پیک مربوط به کلروژنیک و کافئیک اسید در نمونه‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد. برای اطمینان بیشتر نمونه‌ای همراه با استاندارد تزریق و پیک مربوطه دقیقا در زمان پیک استاندارد ظاهر شد.

میزان کلروژنیک اسید و کافئیک اسید بر حسب درصد بیان می‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌های تزریق شده به‌دست می‌آوریم . واحد مجهول (x) بر حسب پی‌پی‌ام می‌باشد. پی‌پی‌ام مقدار میلی‌گرم در 1000 سی‌سی است که با توجه به اینکه عصاره خشک قبل از تزریق در محلول 1 میلی‌لیتر متانول حل شده بود، مقدار میلی‌گرم کلروژنیک و کافئیک اسید در حجم 1 میلی‌لیتر به‌دست می‌آوریم و سپس به گرم تبدیل کرده و درصد بیان می‌کنیم.