قبل از اندازهگيري فروكتوز، ابتدا بايد منحني استاندارد فروكتوز رسم گردد كه براي رسم آن 5 ميلي‌گرم فروكتوز را در 50 ميلي‌ليتر آب مقطر حل مي‌كنيم. لازم به ذكر است كه براي آنكه دقت اندازهگيري بيشتر گردد مي‌توان 5 ميلي‌ليتر از اين محلول مادر را تا حجم 50 ميلي‌ليتر مقطر رقيق و استفاده كرد. پس از تهيه محلول فروكتوز، در لوله‌هاي آزمايش شيشه‌اي مقادير 0، 2/0، 4/0، 6/0،8/0 و 1 ميلي‌ليتر از محلول استاندارد، اضافه گرديد. در نهايت حجم محلول‌ها با آب مقطر به 2 ميلي‌ليتر رسانده شد. لوله آزمايشي كه فاقد فروكتوز بود به‌عنوان شاهد استفاده شد (بلانك). پس از آن 1 ميلي‌ليتر معرف ري‌سورسينول و 7 ميلي‌ليتر اسيد كلريدريك رقيق به هر كدام از لوله‌هاي آزمايش به‌ترتيب اضافه شد و پس از اضافه كردن، لوله‌هاي آزمايش به‌مدت 10 دقيقه در حمام آب گرم با دماي 80 درجه سانتي‌گراد قرار گرفتند و سپس لوله‌هاي آزمايش را به‌مدت 5 دقيقه در آب شير غوطه‌ور كرده تا خنك شوند. بعد از آن جذب محلول رنگي هر يک از نمونه‌ها در طول موج 520 نانومتر در فاصله 30 دقيقه قرائت گرديد ( جدول و شكل زير).
جدول2. طرز تهيه نمودار استاندارد قند فروكتوز
اندازهگيري قندهاي غيراحيايي
قندهاي غيراحيايي به روش هاندل (1968) اندازهگيري شدند. بدين منظور 1/0 ميلي‌ليتر از عصاره الکلي تغليظ شده با 1/0 ميلي‌ليتر هيدروکسيد پتاسيم 30 درصد مخلوط شده و به‌مدت 10 دقيقه در بن‌ماري در دماي 100 درجه سانتي‌گراد قرار داده شد. پس از سردشدن لوله‌ها، 3 ميلي‌ليتر معرف آنترون به آن افزوده و به‌مدت 20 دقيقه در بن‌ماري با دماي 40 درجه سانتي‌گراد قرار گرفتند. سپس جذب نور هر يک از نمونه‌ها در طول موج 620 نانومتر قرائت شد. در نهايت با توجه به فرمول به‌دست آمده از نمودار استاندارد و جذب نور در نمونه‌ها ميزان قند غيراحيايي به‌دست مي‌آيد.
تهيه نمودار استاندارد قندهاي غيراحيايي
براي تهيه نمودار استاندارد از محلول ساکارز با غلظت يک ميلي‌گرم در ميلي‌ليتر آب مقطر استفاده شد. به هر لوله آزمايش، مقادير 0، 20، 40، 60، 80، 100 ميکروليتر از محلول پايه ساکارز که به‌ترتيب حاوي 0، 20، 40، 60، 80، 100 ميکروگرم ساکارز بودند، اضافه گرديد. در نهايت حجم لوله‌هاي آزمايش با آب مقطر به 100 ميکروليتر رسانده شد. لوله آزمايشي که فاقد ساکارز بود، به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شد. سپس به مخلوط حاصل 1/0 ميلي‌ليتر محلول هيدروکسيد پتاسيم 30 درصد اضافه و به‌مدت 10 دقيقه در بن‌ماري در دماي 100 درجه سانتي‌گراد قرار داده شد. پس از سردشدن لوله‌ها، 3 ميلي‌ليتر معرف آنترون به آن افزوده و به‌مدت 20 دقيقه در بن‌ماري با دماي 40 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت. پس از سرد شدن لوله‌ها، جذب نور در طول موج 620 نانومتر قرائت و نمودار استاندارد قندهاي غيراحيايي رسم گردي
دجدول طرز تهيه نمودار استاندارد قندهاي غير احيايي
استاندار قندهاي غير احيايي
نکات
محلول پس از اضافه شدن معرف آنترون زرد و پس از حمام سبز رنگ شد.
نمونه ي شاهد زرد رنگ باقي ماند.
دقت شود در اين کار وسايل مورد استفاده شده کاملا تميز و خشک باشند.
استخراج و اندازهگيري نشاسته
استخراج نشاسته
استخراج نشاسته با روش مک‌کريدي و همکاران (1950) صورت گرفت. در اين روش 40 ميلي‌گرم از بقاياي بافتي به‌جا مانده عاري از روغن و قندهاي محلول را در ميکروتيوب ريخته و 2/0 ميلي‌ليتر آب مقطر به آن افزوده و در يخ نگهداري شد و بلافاصله به آن 26/0 ميلي‌ليتر اسيد پرکلريک 52 درصد افزوده و به‌مدت 15 دقيقه در يخ نگهداري شد. پس از گذشت اين مدت، 4/0 ميلي‌ليتر آب مقطر به آن افزوده و به‌مدت 10 دقيقه با سرعت g 5800 سانتريفيوژ گرديد. پس ازسانتريفيوژ، فاز بالايي به درون لوله آزمايش منتقل شد و در يخ نگهداري گرديد .رسوبات باقي مانده نيز با 1/0 ميلي‌ليتر آب مقطر و 13/0 ميلي‌ليتر اسيد پركلريك 52 درصد مجددا استخراج و پس ازسانتريفيوژ، فاز بالايي آن به لوله اول منتقل شد و در نهايت حجم فاز محلول درون لوله آزمايش با آب مقطر به 2 ميلي‌ليتر رسانده شد و از آن براي اندازهگيري نشاسته استفاده شد.
اندازهگيري نشاسته
براي اندازهگيري نشاسته از روش مک‌کريدي و همکاران (1950) استفاده شد. در اين روش، 2/0 ميلي‌ليتر از عصاره حاوي نشاسته با 3 ميلي‌ليتر از معرف آنترون مخلوط و به‌مدت 20 دقيقه در دماي 100 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت. پس از سرد شدن لوله‌ها جذب نور نمونه‌ها در طول موج 620 نانومتر قرائت شد.
براي تهيه نمودار استاندارد از محلول نشاسته با غلظت 1 ميلي‌گرم در 1 ميلي‌ليتر استفده شد. در لوله‌هاي آزمايش، مقادير 5، 20، 40، 60، 80 و 100 ميكروگرم نشاسته بودند اضافه گرديد. در نهايت حجم لوله‌ها با آب مقطر به 2/0 ميلي‌ليتر رسيد و لوله آزمايشي كه فاقد نشاسته بود به‌عوان شاه در نظر گرفته شد. سپس مطابق روشي كه در بالا ذكر گرديد كمپلكس رنگي توليد و ميزان جذب نور در طول موج 620 نانومتر اندازهگيري شد و نمودار استاندارد رسم گرديد.
نكته: براي تهيه 100 ميلي‌ليتر معرف آنترون، ابتدا 76 ميلي‌ليتر اسيدسولفوريك 98 درصد با 30 ميلي‌ليتر آب رقيق شد. بعد از سرد شدن 150 ميلي‌گرم آنترون در آن حل گرديد و در ظرف كهربايي نگهداري شد.
نكته: لازم به ذكر است كه اسيد بايد كم كم در آب ريخته شود و آب در اسيد ريخته نشود زيرا احتمال خطر وجود دارد.
طرز تهيه نمودار استاندارد نشاسته به روش مک‌کريدي و همکاران (1950)
تعيين غلظت کلروفيل a ، b و کل با روش آرنون
ابتدا 100 ميلي‌گرم از بافت تر گياه در داخل هاون چيني با 10 ميلي‌ليتر استن 80 درصد ساييده شد. سپس محلول حاصل به لوله‌هاي سانتريفوژ انتقال و بقاياي موجود در هاون، با مقداري استن 80 درصد شسته و به محلول درون لوله اضافه گرديد. سپس لوله‌ها به‌مدت 10 دقيقه در rpm 6000 سانتريفوژ شدند. محلول فوقاني به بالن ژوژه 25 ميلي‌ليتري انتقال يافته و حجم آن توسط استن 80 درصد به 25 ميلي‌ليتر رسيد. اندازهگيري کلروفيل با روش اسپکتروفتومتري با دستگاه اسپکتروفتومتر شيمادزو مدل (Shimadzu UV-160) انجام گرفت. به اين ترتيب که مقدار جذب محلول‌ها را در طول موج 645 و 663 نانومتر خوانده و مقدار کلروفيل a، b و کل بر اساس روابط زير محاسبه گرديد:
Chl.a mg/g FW=[ 7/12 ( A663) – 69/2 (A 645)] × V/W
Chl.b mg/g FW=[ 9/22 ( A645) – 68/4 (A 663)] × V/W
Chl. total mg/g FW=[ 2/20 ( A645) + 02/8 (A 663)] × V/W
663A و 645A به ترتيب عبارتند از مقدار جذب خوانده شده در طول موج 663 و 645 نانومتر، V حجم نهايي استن مصرفي بر حسب ميلي‌ليتر و W وزن بافت تر است.
استخراج اجسام روغني و اندازهگيري آتوليز آن‌ها با روش اسپکتروفتومتري
استخراج اجسام روغني از روش صادقي‌پور و باهاتلا (2002) انجام شد. ابتدا 2 گرم بافت لپه با 6 ميلي‌ليتر بافر استخراج شامل تريس بازي 1/0 مولار با اسيديته 5/7، ساکاروز 4/0 مولار، کلريد پتاسيم 10 ميلي‌مولار، سولفات‌منيزيم 1 ميلي‌مولار، اتيلن دي آمين تترا استيک اسيد (ETDA) 1 ميلي‌مولار، فنيل متيل سولفونيل‌فلورايد (PMSF) 1 ميلي‌مولار، پلي ونيل پلي پيروليدون (PVPP) 6/0 درصد و 2- مرکاپتواتانل 50 ميلي‌مولار در اون سرد خرد و هموژنيزه گرديد. سپس عصاره حاصل پس از صاف شدن توسط دو لايه پارچه ململ، به‌مدت 15 دقيقه در g × 5800 سانتريفوژ شد و فاز رويين روغني براي اندازهگيري فعاليت آنزيم ليپاز به‌کار رفت.
اندازهگيري فعاليت آنزيم ليپاز
فعاليت آنزيم ليپاز به روش صادقي‌پور و باهاتلا (2002) انجام گرديد. در اين روش فاز رويين روغني برداشت شده پس از سانتريفوژ در 2 ميلي‌ليتر بافر تريس 20 ميلي مولار با اسيديته 5/7 حاوي ساکاروز 2/0 مولار به‌طور کامل هموژن گرديد. سپس 1/0 ميلي‌ليتر از مخلوط حاصل با 9/0 ميلي‌ليتر بافر استات سديم 1/0 مولار با اسديته 5/4، بافر تريس 1/0 مولار با اسديته 5/7 و 9 مخلوط گرديد و در حمام آب گرم با دماي °C 35 نگهداري شد و در فواصل ده دقيقه‌اي به‌مدت يک ساعت، هر بار 1/0 ميلي‌ليتر از مخلوط واکنش برداشت شد و در دماي °C 90 فعاليت آنزيمي متوقف گرديد. ميزان اسيدچرب آزاد شده در مخلوط واکنش به روش اسپکتروفتومتري (1969) Chakrabarty et al. اندازهگيري شد. مقادير برداشت شده از زمان‌هاي مختلف با 1 ميلي‌ليتر بنزن با استفاده از ورتکس مخلوط گرديد تا اسيدهاي‌چرب آزاد شده در فاز بنزني استخراج شوند. پس از سانتريفوژ به‌مدت 5 دقيقه در g × 1000، مقدار 4/0 ميلي‌ليتر از فاز بنزني برداشت شد و با 6/1 ميلي‌ليتر بنزن مخلوط گرديد و در نهايت 1 ميلي‌ليتر معرف رودآمين 6G به آن افزوده شد. پس از گذشت 30 دقيقه جذب نور در طول موج 535 نانومتر اندازهگيري شد.
براي تهيه نمودار استاندارد اسيدچرب به لوله‌هاي آزمايش 100 × 12 ميلي‌متري مقادير 0، 40، 80، 120، 160، 200، 240 و 280 ميکرومتر از محلول اسيد استئاريک در بنزن که به‌ترتيب حاوي 0، 80، 160، 240، 320، 400، 480 و 560 نانومول اسيدچرب بودند، منتقل گرديد. در نهايت حجم لوله‌هاي آزمايش با محلول بنزن به 1 ميلي‌ليتر رسانده شد. لوله آزمايشي که فاقد اسيد استئاريک بود به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شد. سپس 5/0 ميلي‌ليتر معرف رودآمين 6G به آن افزوده شد و جذب نور آن‌ها در طول موج 535 نانومتر به دست آمد (جدول2-5). در نهايت با استفاده از مقادير جذب نور بدست آمده نمودار استاندارد اسيدچرب رسم گرديد.
براي تهيه معرف رودآمين ابتدا 25 ميلي‌گرم رودآمين 6G در 25 ميلي‌ليتر بافر فسفات (KH2PO4) 2/0 مولار با اسيديته 7/9 و سود (NaOH) 2/0 مولار حل شد. سپس محلول حاصل با 500 ميلي‌ليتر بنزن در يک قيف جدا کننده (دکانتور) استخراج گرديد. در نهايت فاز آبي دور ريخته شد و فاز بنزني نارنجي رنگ به ظرف کهربايي منتقل شده و پس از افزودن اندکي سود در تاريکي نگهداري گرديد.
طرز تهيه نمودار استاندارد اسيدچرب به روش (1969) Chakrabarty et al
