1- گیاه مورد آزمایش : به عنوان مثال، بعضی گونه ها به نمک حساس هستند؛ در حالی که گونه های دیگر می توانند غلظت بالای نمک را تحمل کنند. بعضی گونه ها به افزایش ویتامین B1 واکنش نشان می دند نیازبه تنظیم کننده ها خصوصا اکسین ها و سیتوکنین ها نیز خیلی متغیر است و موارد دیگر... 68
2- سن گیاه : بافت های جوان می توانند بدون اکسین ریشه زایی کنند اما بافت های مسن به اکسین نیازمندند.
3- سن اندام: اندامهای جوان( در حال تقسیم سریع سلولی) نسبت به سایر بافت ها داری نیازهای مختلف هورمونی هستند.
4- نوع اندام مورد کشت: اگر ریشه ها کشت شوند، نیار به افزودن ویتامینB1 می باشد
5- در کشتسوسپانسیون( معلق) چنانچه کالوسها برای مدت زمان طولانی نگهداری شوند نیاز کمتری به تنظیم کننده های رشد دارند.
6- در حالت این ویترو، نیاز های خاص خود را دارند. به عنوان مثال ریشه های نابجا غالبا فقط بعد از اضافه کردن اکسین ظاهر می شوند، در حالی که ساقه های نابجا می توانند بعد از افزایش سیتوکنین ظاهر شوند. زمانی که نیازهای غذایی یک گیاه نا معلوم است بشرط اینکه گیاه به غلظت بالای نمک حساس نباشد، می توان از مخلوط عناصر پر مصرف و کم مصرف موراشی و اسکوگ ( 1963) استفاده کرد.
اگر گیاه کمی به نمک حساس است می توان از مخلوط عناصر پر مصرف و کم مصرف هلر ( 1953) استفاده کرد. و چنانچه گونه به این نمک خیلی حساس باشد مخلوط عناصر پر مصرف ناب ( 1984) را میتوان انتخاب کرد. فرم معمول قند بین 3-2 % ساکاروز است. اگر یک محیط کشت جامد مورد نیاز باشد ، نهایت 7/0 % آگار از نوع دیفکوباکتر به عنوان ماده ژله اضافه می گردد. توصیه میزان اکسین و سیتوکنین خیلی مشکل است و جزئیات مربوط به آن ، در بخش 7-4-6 داده شده است. افزودن ویتامین ها و ترکیبات متفرقه به ترتیب در بخش های 8-4-6 و 9-4-6 آماده است.
4-6-ترکیب
1-4-6- آب
به کیفیت آب ، توجه زیادی باید معطوف شود، زیرا 95 درصد از محیط کشت را آب تشکیل می دهد. توصیه می شود، برای موارد تحقیقاتی ، آبی به کار برده شود که در ظروف شیشه ای پیرکس ، تقطیر شده باشد. و برای تحقیقات با پروتوپلاست، سلول و مریستم، از آبی که دوباره تقطیر گردیده است استفاده می شود. برای اطمینان کامل از آب مقطر با کیفیت خوب، دستگاه مولد آب مقطر باید بطور منظم به منظور جلوگیری از جرم ، تمیز شده و قبل از استفاده، با آب فاقد یون شسته شود. برای احتراز از ذرات بجا گذاشته شده آب یونیزه شده در دستگاه آب مقطر، باید یک صافی بین دستگاه سازنده آب یونیزه و دستگاه تقطیر جاسازی شود.
در سالهای اخیر برای کشت بافت از آبی استفاده می شود که توسط اسمز برگشتی خالص سازی شده است. پس از این خالص سازی ، می تواند با سایر روشهای خالص سازی نظیر یونیزه کردن، تقطیر و فیلتراسیون ، همراه گردد. بهتر است برای نگهداری آب مقطر
اگار ها
محيط هاي كشت مايع
شيشه اي شدن
از صفحه 69 تا 79 وجود ندارد
//////////////////////////////////////////////////
این حالت ، موارد زیر را سبب می شود:
1-در نتیجه کاهش یافتن جذب آب ، ویتریفیکاسیون ، کمتر می شود.
2-از افزایش ساقه های جانبی جلوگیری می شود.
3-پتانسیل ماتریکس تغییر می کند ( جذب آب مشکلتر می شود)
4-سبب می شود که تماس قلمه با ماده غذایی کمتر شود( افزایش مشکل جذب آب)
5- در اختیاز بودن عناصر ماکرو و میکرو که به محیط کشت اضافه شده اند، بسته به غلظت آگار،تغییر می کند.
3-4-6-قند
قند جزء بسیار مهمی در هر نوع محیط کشت است، و چون معمولا شرایط رشد برای فتوسنتز کافی نیست، و یا اصولا به علت تاریکی ، فتوسنتز انجام نمی شود، اضافه ترکردن قند به محیط زیست ، ضروری است. بافتهای سبز در حالت این ویترو ، به قدر کافی اتو تروف (خودساز) نیستند. غلظت CO2 درداخل لوله آزمایش نیز می تواند برای فتوسنتز محدود کننده باشد ( گیبسون 1997) در عمل ،اضافه کردن CO2 خیلی مشکل و گران است . در واقع اهی تبادلات ضعیف گازی سبب میش ود که غلظت در لوله های آزمایش یا سایر ظروف CO2 در لوله های آزمایش یا سایز ظروف خیلی بالا رفته و در نتیجه مسومیت ایجاد کند. معمولا در کشت این ویترو ، از ساکارز با غلظت 1 تا 5 درصد استفاده می شود زیرا این قند نیز به وسیله گیاه سنتز شده و به صورت طبیعی در گیاه منتقل می شود. از گلوکز و فروکتوز نیز ممکن است استفاده شود. غلظت قندانتخاب شده بستگی زیادی به نوع و سن مواد در حال رشد دارد. به عنوان مثال جنینهای بسیارجوان ، به غلظت نسبتا بالایی از قند احتیاج دارند. معمولا با افزایش غلظت قند رشد و نمو زیاد می شود، تا وقتی که به یک حد اپتیمم برسد و سپس در غلظت ( خیلی) بالا کم می شود( شکل 5-6) رشد گیاه کامل مثل گیاهچه ای های ارکیده نیز به میزان زیاد تحت تاثیر غلظت قند قرار دارد( شکل 6-6) ساکارز یا قند معمولی که از بازار خریداری می شود معمولا کافی است زیرا قند خالص شده است و طبق آزمایشات کارخانه های سازنده دارای 94-99 درصد ساکارز، 02/0 درصد آب ، 04/0 درصد سایر مواد ( مواد آلی و همچنین رافینوز ، فروکتوز ، گلوکز) است. هیچ دلیلی وجود ندارد که نشان دهد سایر مواد آن ، بتوانند در محیط کشت این ویترو سمیت ایجاد کنند.
همان گونه که در قسمت 2-3-5 بیان شد قند می تواند در نتیجه اتوکلاو کردن، تغییراتی پیدا کند که PH یکی از عوامل مهم است ( بخش 5-4-6)باید این مسئله را نیز در نظر داشت که طی کاشت این ویترو ( مثلا باکشت ریشه) قندها می توانند در محیط کشت تغییر یابند. هیدرولیز ساکارز در نتیجه آنزیم اینورتاز ( از دیواره های سلولی) یا از طریق آنزیم های خارج سلولی[3] ( بورلترم 1957 و ستون و استریت 1968) صورت می گیرد . همچنین تغییر ترکیب قند محیط کشت در کشت کالوس هم می تواند اتفاق افتد ( جورج و شرینگتون 1984) در این جا به نظر می رسد که وجود یا عدم IAA در محیط کشت خیلی مهم است. سایر قندها نیز می توانند به وسیله بافتهای گیاهی ، هیدرولیز شوند.
مارتزکی و همکاران (1971) نشان داده اند که هیدرولیز نشاسته خارج سلولی درزمان رشد سوسپانسیون سلولی نیشکر امکان پذیر است.
مشکل است بتوان گفت اتوکلاو کردن قندها در کشت این ویترو قابل توصیه است یا خیردر منابع هم روی این مساله ابهاماتی وجود دارد، در بعضی موارد ، اتوکلاو کردن توصیه شده ( بال 1953) و در مواردی توصیه نشده است ( استهزل و کاپلین 1969). برای انجام موفق یک آزمایش و يا توليد و تكثير گياه از طريق کشت بافت و ايجاد اندامهاي نابجا در قطعات گياهي مورد كشت و يا وادار نمودن انها به جنین زایی رويشي، تركيب محیط کشت که نمونه ها در ان قرار ميگيرند، نقش اساسی و سرنوشت ساز دارد. اگر چه گیاهان الی كه واجد تمام اندامها بوده، اتوتروف ميباشند و ميتوانند در حضور نور، اتمسفر نرمال، اب و مواد غذایی کافی بخوبی رشد نمايند، ولی اندامها و بافت های جداشده از انها اين توانايي را از دست داده و پس از جداشدن از گياه مادري و كشت در لوله ازمايش هتروتروف ميگردند. لذا اين مواد گياهي نياز دارند كه مواد غذايي بطور كامل در اختيارشان قرار گيرد. در يك گياه كامل برای اينكه سلولهای ریشه رشد نمايند به مواد غذایی تهيه شده توسط شاخ و برگ نیاز دارند. علاوه بر مواد غذايي رشد اندامهاي گياه تحت تاثیر هورمون¬های که در اندامهای بخصوص ديگري از همان گياه سنتز می گردند و از طرق مختلف مثلا از طریق اوند ها و يا بافت هاي پارانشيمي به منطقه مورد نظر رسیده نيز کنترل ميگردد. در بذور گياهان نيز وضع به همين منوال بوده و جنين درون انها جهت جوانه زنی متكي به مواد غذايي و هورمون¬هايي هست كه در بخش هاي ديگر بذر ذخيره و يا سنتز ميگردند. بنا بر این چون یک بافت بخصوص در طی مراحل رشدی خود وابسته به واردات این مواد از نقاط دیگر گیاه می باشد، لذا از این لحاظ یعنی نیاز هورمونی و غذايي می تواند فقط در یک گیاه کامل اتوتروف محسوب گردد. در کشت بافت نيز سلولهای زنده یک قطعه جدا شده از یک گیاه كامل دراي موقعیتي شبیه به یک بافت مشخص درون گیاه کامل ميباشند ولي با اين تفاوت كه در مورد كشت بافت این محیط کشت می باشد که وظیفه رسانیده مواد غذایی را که در گیاهان کامل بعهده سایر بافت ها و اندام ها است، به عهده دارد (تصوير بعد). لذا در کل این گونه کشت ها هتروتروف ميباشند و در حالات استثنايي بعضي از انها در حضور نور و پس از تکامل کلروپلاست داراي یک سیستم فتومیکسوتروف ميگردند (Neumann, 1995). در این کشت ها انرژی مورد مصرف اندامها مورد كشت از طریق ارائه مواد غذایی مختلف مانند هیدروکربن هاي اضافه شده به محیط کشت تامين ميگردد كه در ادامه در باره هركدام از انها بحث ميشود.
الف- قندهاي محیط های کشت
هیدرو کربن ها موجود در محیط های کشت به فرم مونو و دی ساکارید می باشند ولي در اغلب موارد اين ساکاروز است كه در غلظت های متفاوت مورد استفاده قرار می گیرد و در اغلب ازمایشات نيز نتیجه رضایت بخشی را ارائه نموده است (Charriere and Hahne, 1998; LilienKipnis et al. 1994).
البته ساكارز تنها منبع كربوهيدرات مورد مصرف در محيط كشت نبوده بلكه استحصال یک رشد خوب در اندامهاي گياهي موجود در کشت بافت می تواند توسط مونوساکارید ها و حتي تعداد زیادی از مواد تغییر شکل نیافته دیگر مانند اب پنیر که بعنوان منبع قندها محسوب می گردند نيز بدست اید. بطور مثال در بررسي ديكلارك و كوربان برروي اثر تنظيم كننده هاي رشد و نوع قند برروي تشكيل كالوس درخت هلو واريته البرتا در محيط جامد (MS) مشاهده گرديد كه نمونه هاي مورد كشت برگ اين گياه كه در محيط كشت حاوي گلوكوز قرار داشتند مقدار زياد تري كالوس سبز رنگ متراكم نسبت به انهايي كه در محيط كشت حاوي فروكتوز و يا ساكاروز قرار داشتند نمودند (Declerck and Korban, 1996):. و همچنين وقتي كه قطعات برگ گل سرخ از محيط كشت حاوي 100 mu M) 2,4-D) به محيط كشت باززايي منتقل شدند، اين نوع قند اعم از اينكه گلوكز باشد و يا ساكاروز مشخص كننده نوع اندام بوجود امده اعم از اينكه تشكيل ساقه نابجا گردد و يا جنين رويشي و يا هر دو تشكيل شوند بود (Hsia and Korban, 1996). و يا جهت القاء جنين زايي رويشي در گياه نخود (Pisum sativum L.) بهترين نتيجه در غلظت(252-504 mM); فروكتوز بدست امد، بطوريكه تعداد جنين هاي تشكيل شده سه تا چهار برابر تيمار شاهد يعني ساكاروز با غلظت 84 ميلي مول بود (Loiseau et al. 1995). از طرف ديگر گزارش شده است كه در بعضي از مواقع بعضي از انواع قند ها از قبيل گالاكتوز، رافينوز و استاكيوز نه تنها باعث تسريع جنين زايي نميگردند، بلكه باعث تاخير در توليد جنين ها نيز ميشوند .(Verma and Dougall, 1977)