3- نقص جریان هوای استریل در محفظه استریل محفظه تمیز ، بایستی سالی یک بار توسط یک نفر متخصص از کارخانه سازنده ، آزمایش شوند ، و فیلتر جلوی آن ، بطوری دوره ای ، عوض شود .
4- الکلی که از آن برای ضد عفونی وسایل استفاده می شود ، آلوده بوده ، که بهتر است این الکل بطور منظم عوض شود .
5- قرار دادن لوله ها و سایر وسایل آزمایش ، حامل محیط کشت در محیط غیر استریل ، بعد از ضد عفونی محیط کشت ، بایستی در شرایط استریل ، نگهداری شوند .
6- ضد عفونی نکردن کف اتاق کار ، بایستی پلاستیکی روی کفش ها کشیده شود ، و یا کف کش ها در مایع استریل ، قرار داده شوند .
7- اتاقی که محفظه ی تمیز در آن قرا داد ( تمیز نبوده و یا هوا در آن جریان داد ) . این مشکل را می توان از راه جریان هوای استریل یا به وسیله ی تابش اشعه ماورای بنفش ، در طول شب ، مرتفع کرد .
8- رفت و آمد زیاد افراد به اتاق کار ، باعث آلودگی کف و هوای آن می شود.
9- اغلب هنگامی که از اندامهای هوایی گیاه و قسمت هایی از گیاه که روی سطح خاک پهن شده است ، استفاده می شود ، آلودگی اتفاق می افتد ؛ زیرا استریلیزه کردن اینها ، کمی مشکل است . برای جلوگیری از این امر ، اندام های هوایی ، طی مراحلی ، استریلیزه می شوند . اندام های هوایی را ابتدا پس از شستشو و ضد عفونی ، تعدادی برگ از آن استریلیزه شده ، چند برگ جدا می شوند ؛ سپس عمل استریل ، مجدداً تکرار می شود . بطور کلی ، آلودگی توسط قسمت های هوایی ، هنگامی که هنوز کوچکتر هستند ، کمتر است . ترجیحاً باید یک مریستم همراه با چند برگ جدا شود . عیب آن ، این است که رشد آن در محیط این ویترو ، کندتر است .
10- اگر اتاق های رشد کاملاً تمیز نباشد . ( کف اتاقها مرتباً تمیز و ضد عفونی نشده اند ) آلودگی ممکن است در بعضی مواقع توسط کنه ها که ناقل بیماری های قارچی هستند ، انجام شود . از آن جا که این کنه ها براحتی از میان گلوله های پنبه ای و ورقه های پلاستیک درپوش ، عبور می کنند ؛ خطر این آلودگی ، قابل تخمین است . مناسب ترین روش برای ریشه کن کردن کنه ها ، استفاده از حشره کش نواری و پونا[63] به مدت چند هفته است ( بونگاو دورزان 1982 ) .
2-9- ضد عفونی شیمیایی
ضد عفونی یا استریلیزاسیون شیمیایی ( از بین بردن میکرو ارگانیسم ها توسط مواد شیمیایی ) می تواند به صورت های ذیل , انجام شود :
1- الکل ( اتانول ) : از الکل 70 درصد ، برای ضد عفونی مواد گیاهی ، استفاده می شود ؛ زیرا الکل 96 درصد ، باعث دهیدراته شدن زیاد ، می شود . از الکل 96 درصد ، برای ضد عفونی ابزار و میزکار ، استفاده می شود ؛ چون استفاده از الکل 70 درصد ، سبب می شود که پس از تبخیر آن ، یک لایه آب بر روی آنها باقی بماند ، فرو بردن مواد گیاهی برای مدت چند ثانیه در الکل برای از بین بردن تمام میکرو ارگانیسمها ، کافی نیست چون الکل فقط موجودات سطحی را از بین می برد. ( برای حذف هوا ، الکل ، لایه اپی کوتیکولار را نیز در خود حل می کند ) و بعد از آن ، بایستی با هیپوکلریت ، ضد عفونی صورت گیرد . ضد عفونی سطحی میوه ها را می توان با فرو بردن آنها در الکل 96 در صد ، و سپس قرار دادن روی شعله انجام داد . این روش برای ضد عفونی بزور ارکیده نیز به کار رفته است .
2 – وایتکس ( هیپوکلریت سدیم ) : این ماده در اکثر فروشگاهها و خواروبار فروشی ها وجود دارد و دارای ده درصد ماده فعال است . معمولاً از هیپوکلریت سدیم یک درصد ، استفاده می شود . برای تهیه آن ، یک قسمت هیپوکلریت سدیم ( یا 10 درصد ماده فعال ) و 9 قسمت آب ، مخلوط می کنیم ، اگر چه گاهی از غلظتهای بالاتر ( 5/1 تا 2 درصد ) نیز می توان استفاده کرد . چنانچه گیاهان به هیپوکلریت سدیم حساس باشند ، از هیپوکلریت کلسیم برای ضد عفونی استفاده می شود .
روش هاي مختلف نگهداري محيط هاي كشت
الف- محيط كشت هايي كه برروي دستگاه لرزان قرار دارند. سرعت دوران يكي ديگر از عواملي است كه برروي رشد كالوس، اندام زايي و القاء جنين زايي سوماتيكي موثر است. مندرجات جدول 6-24 نشان ميدهد كه رشد كالوس جنين زا ميتواند تحت تاثير سرعت دوران محيط كشت قرار گيرد.
جدول 6-24: اثر سرعت هاي متفاوت تكان دادن محيط كشت برروي توليد كالوس درخت كاج پيسه آ ويلسوني (Yinggen and Zhongchen,1999).(Picea wilsonii).
سرعت دوران (دور در دقيقه) |
حجم كالوس (گرم وزن تر در 100 ميلي ليتر) |
درصد ميزان رشد كالوس |
50 |
3،16 |
57،67 |
100 |
7،37 |
268،5 |
150 |
4،04 |
101،64 |
200 |
3،7 |
84،95 |
در اينجا ميزان رشد كالوس در سرعت دوراني 100 دور در دقيقه افزايش يافته است. همچنين به دليل وجود همبستگي منفي بين مدت زمان فاز توقف phase length) (lag كه باعث تاخير در تقسيم سلولي در شروع كشت ميگردد و سرعت دوران محيط كشت هيچگونه تفاوتي بين تيمار 50 و 200 دور در دقيقه مشاهده نمي گردد. از اين جهت است كه در سرعت دوران زياد و درنتيجه فاز تاخيري كوتاه تر، مصرف مواد غذايي محيط كشت سريعتر ميگردد. به همين شكل در سرعت 200 دور در دقيقه فاز لگاريتمي (logarithmic) تقسيم سلولي بلافاصله توسط فاز سكون و تنزلي تعقيب ميگردد و به اين دليل مواد غذايي موجود در كشت پس از گذشت پنج روز بطور كامل مصرف و سلولها پير شده و ميميرند. سرعت زياد دوران محيط كشت باعث ايجاد عوامل نامطبوع ديگر از قبيل غلظت زياد اكسيژن محلول كه براي كشت ها سمي ميباشد، استرس زياد ناشي از جداشدن سلولها از يكديگر و خروج گازكربنيك و هم چنين اتيلن ميشود. از اين جهت است كه در اغلب موارد سرعت 100 دور در دقيقه براي چرخش كشت ها انتخاب ميشود (Yinggen and Zhongchen, 1999).
.(Street, 1973; Martin, 1980) استفاده از بيوراكتور در مقايسه با كار در فلاسك هاي ارلن ماير داراي سودمندي هاي بيشتري از قبيل حجم بيشتر توليد مواد گياهي، كشت يكنواخت تر و امكان كنترل محيط كشت بهتر ميباشد(Tautorus and Dunstan, 1995) . قبل از اینکه مواد اوليه گیاهی به بیو راکتور منتقل گردند باید یک عمل پیش کشت را پشت سر بگذارند. بدین صورت که مثلا در یک بالن ارلن مایر به حجم 750 میلی لیتر كه حاوی حدود 200 میلی لیتر محیط کشت حاوي کینتین است، مقدار 1-2 گرم سلول به اندازه هاي (90-250 µm)اضافه می گردد و سپس برروي دستگاه لرزاننده قرار داده ميشود. این پیش کشت وظیفه تکثیر اولیه مواد را بعهده دارد. پس از گذشت ده تا چهارده روز از شروع كشت، تمام محتویات درون ارلن مایر یعنی مواد گیاهی و محیط کشت به بیو راکتور منتقل می گردد. در مورد کشت های درون ظروف کشت معمولی نیز روش به همين شكل است، با اين تفاوت كه سلولها به جای بیوراکتور به ارلن مایر هاي جدید منتقل می گردند. بديهي است برای اینکه سلولها قدرت تقسیم خود را حفظ نموده و برای مدت زیادی زنده بمانند بایستی هر یک تا دو هفته یکبار مرتبا باز کشت گردند. البته مدت مورد نياز جهت بازکشت بستگی به عوامل دیگری مثل نوع گیاه نیز دارد که باید برای كشت سلول هر گياه خاص مشخص گردد. راحت ترین روش بازکشت اینست که کشت تعلیق سلولی هر یک هفته یکبار به نسبت یک به پنج ویا هر دو هفته یکبار به نسبت یک به ده با محیط کشت جدید رقیق گردد.
ج- دستگاه دیگري که اغلب می تواند جای شیکر را بخوبي بگیرد و درضمن عمل هوادهی به نمونه ها را به نحو احسن انجام دهد، دستگاه اكسوفيتون ((Auxophyton می باشد (تصوير 6-7). اين دستگاه ها طوري ساخته ميشوند كه كشت هايي را كه درون لوله هايي مخصوصي قرار دارند را در حول محور افقي بچرخاند. دستگاه اكسوفيتون اين امكان را فراهم ميكند كه درون لوله هاي كشت يك حالت جريان چرخشي ارام از مايع بوجود بيايد و از اين طريق به نمونه هاي مورد كشت اين اجازه را بدهد كه متناوبا از محلول كشت خارج شده و پس از هوادهي دوباره در ان غوطه ور گردند. در اين حالت در مقايسه با كشت هاي درون ارلن ماير هايي كه در روي دستگاه لرزاننده قرار دارند، در دستگاه اكسوفيتون سلولها با
ح- خطر كمبود اكسيژن و خفگي در محلول كمتري روبرو ميگردند. به همين دليل كشت ها در اين دستگاه حتي بهتر از محيط هاي كشت نيمه جامد رشد مينمايند.
امروزه دستگاه اكسوفيتون در تعداد زيادي از ازمايشگاه هاي كشت بافت در خارج از كشور مورد استفاده قرار ميگيرد و حتي بر اساس ساختمان ان دستگاه هاي ديگري نيز ساخته شده كه بجاي لوله هاي استوارد، ارلن ماير ها در روي انها قرار ميگيرند و اندامهاي مورد كشت متناوبا از محلول غذايي خارج شده و بدين وسيله هوا دهي ميشوند. اما همانطور كه گفته شد اين دستگاه ها نيز از لحاظ ساختمان و كار كرد اقتباسي از دستگاه اكسوفيتون استوارد ميباشند(Krikorian, 2000) . طبق تجربيات نگارنده در مقايسه با كشت درون ارلن ماير ها، تشكيل جنين هاي رويشي گياه هويج در لوله هاي تي شكل دستگاه اكسوفيتون استوارد به مراتب بهتر انجام ميگردد(Mashayekhi, 2001) . در این دستگاه در روی صفحات چوبی چرخان که با افق زاويه 10 تا 12 درجه دارند و یک تا دو دور در دقیقه بدور خود میچرخند، گیره هایی وجود دارد که لوله های تی شکل که درب انها به قطر تقریبا 1.5 سانتیمتردر وسط انها قرار دارد، به انها متصل می گردند. با حرکت دورانی این صفحات بدون اینکه محیط کشت از درون این لوله ها به خارج بریزد، عمل هوادهی به نمونه ها انجام می پذیرد. این لوله های تی شکل (T)به قطر داخلی 3 سانتیمتر دارای حجم حدود 70 میلی لیتر بوده که فقط 15 میلیتر محیط کشت درون انها ریخته می شود. در حین گردش تیوب ها نمونه ها توسط لایه ای از محلول محیط کشت به جداره لوله ها چسبیده و بدین طریق هوا دهی به انها بخوبی انجام می گردد(Street, 1973) . استفاده از این روش یعنی کشت درون تیوپ های واقع بر روی دستگاه اكسوفيتون جهت بررسی های فیزیولوژیکی بیوشیمیایی بسیار کارامد تر و نتیجه بدست امده بسیار مطلوب تر از کشت های درون ارلن مایر های روی دستگاه لرزان و همچنین کشت روی اگار می باشد. البته غير از موارد ذكر شده كشت اكسپلنت ها برروي كاغذ هاي صافي شناور برروي محيط كشت مايع و يا برروي اسفنج، گلوله هاي شيشه اي و ساير مواد نيز امكان پذير ميباشد كه محقق بر اساس امكانات موجود از انها استفاده ميكند.
چ- آگارها
نوع ديگر از طرق نگهداري محيط هاي كشت محيط هاي جامد مانند اگار ها ميباشند.
اگار يك پلي ساكاريد مركب است كه از جلبك قرمز بدست ميايد. اگار از دو قسمت اگارز به ميزان حدود 70 درصد و اگاروپكتين به مقدار حدود 30 درصد تشكيل شده است. بخشي از اگار كه باعث توليد ژل ميگردد اگارز است. اگاررز پليمري متشكل از دو واحد تكرار شونده د-گالاكتوز و 6،3-انهيدروگالاكتوز ميباشد. اگاروپكتين كه پليمري از واحدهاي د-گالاكتوز سولفاته است خاصيت توليد ژل را ندارد. اگار در دماي 35 درجه سانتيگراد به شكل ژل در مييايد. اگار هاي مورد استفاده در كشت بافت عبارتند از: