5-3-5-استريل كردن در مدرسه يا منزل

دستگاه اتوكلاو،معمولابراي استفاده در منزل يا مدرسه،بسيار گران قيمت است.ولي بجاي ان،مي توان از ديگ زودپز كه نسبتا ارزان مي باشد،استفاده نمود.محيط كشت،بخوبي درطي30دقيقه ، داخل ديگ زودپز، استريل مي شود. وحجمهاي بزرگتر مثل فلاسكهاي محتوي آب يا بسته هاي  فيلتر كاغذي براي استريل شدن به اين روش ،به60تا 70 دقيقه وقت، نيازدارند.

4-5-اتاق تهيه يااماده سازي محيط كشت

يك ازمايشگاه مجهز ،نياز به يك اتاق اماده سازي دارد،كه وسايل زير،بايددران،وجود داشته باشد:

اتوكلاو ،ماشين ظرفشويي،دستگاه يون زدايي اب، دستگاه تقطير، ظرف شويي(با شير آب گرم و سرد ). بهتر است وسايل فوق كه به نحوي با آب سروكار دارند ، در يك اتاق ، قرار گيرند . استفاده از ماشين ظرف شويي نيز قويا توصيه مي شود .چون شستشوي ظروف با دست ، وقت زيادي مي گيرد .

 فصل ششم

آماده سازي وتركيب محيط كشت

۱-۶-مقدمه

رشد ونمو گياه در محيط اين ويترو،به فاكتورهاي پيچيده ي متعددي،بستگي دارد:

1- ساختار ژنتيكي گياه

2- عناصر غذايي ،شامل آب ،عناصر پر مصرف و كم مصرف و قندها

3- عوامل فيزيكي رشد شامل نور،درجه حرارت،PH ، غلظت O2وCO2

4-بعضي مواد عالي،شامل تنظيم كننده هاي رشد، ويتامين ها وغيره

ساختار ژنتيكي گياه ،يك فاكتور حساس در هر مرحله از رشد گياه ، محسوب مي شود و به عنوان مثال چنانچه گياه دو لپه يا تك لپه باشد، نوع برگ آن متفاوت است و مشخص مي شود، چه حرارتي براي رشد

وگلدهي ان مناسب است،رنگ وفرم گل چيست،ايا گياه ميوه هاي پارتنوكارپي(بدون بذر)توليد مي كند.همچنين بروز ساختار ژنتيكي گياه ،بستگي به شرايط فيزيكي وشيميايي دارد كه بايستي در شرايط اين ويترو ان را ايجاد كرد.

عناصر غذايي براي رشد ونمو گياه ضروري است .بدون اب وعناصر غذايي معدني گياه تحت هيچ كدام از شرايط اين ويترو و يا اين ويوو  قادر به ادامه حيات نيست .

7-4-6- تنظیم کننده های رشد                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                    ١ - ۷-٤- ٦-   مقدمه        

   از نظر تعریف ،هورمونها ،ترکیبات الی هستند که بهصورت طبیعی در گیاهان عالی ساخته می شوند و روی رشد و نمو ،اثر می گذارند . هورمونها معموﻷ در نقاط مختلف گیاه ،فعال هستند.  علاوه بر این ترکیبات طبیعی ،ترکیبات مصنوعی نیز ساخته شده اند که با انواع طبیعی ،مطابقت دارند . مجموع هورمونها ترکیبات مصنوعی تولید شده ،تنظیم کننده های رشد ،نامیده می شوند . اساسا هورمونها مسوول توزیع ترکیباتی هستند که گیاه بیوسنتز می کند . این مواد ،رشد نسبی همۀ اندامها را در گیاه ،تعیین می کنند .                                                                                  

در کشت این ویتروی گیاهان عالی ،تنظیم کننده های رشد ،مخصوصا اکسینها و سیتوکینینها ،خیلی بارز هستند . در واقع ،می توان گفت که غالبا کشت این ویترو بدون وجود تنظیم کننده های رشد ،غیر ممکن است .چگونگی تصمیم در مورد اضافه کردن هورمون اکسین و یا سیتوکینین به محیط کشت جهت رشد و یا تقسیم سلولی ،بستگی به نوع قلمه و گونه های گیاهی ،دارد . به عنوان مثال ،قلمه هایی که خودشان اکسین تولید می کنند ،به اکسین اضافی برای رشد و یا تقسیم سلولی ،نیاز ندارند . همچنین در مورد قلمه هایی که سیتوکینین کافی دارند ،به سیتوکینین اضافی برای افزودن به محیط کشت ،نیازی نیست . با توجه به رشد سلولها ، بافتها ،اندامها و غیره، تقسیم بندیهای زیر را می توان انجام   داد:     87

۱- کشتهایی که ،به اکسین و یا سیتوکینین ، نیاز ندارند .                                                                          

 ٢- کشتهایی که، فقط به اکسین ، نیاز دارند .                                                                               

٣- کشتهایی که ، فقط به سیتوکینین  ، نیاز دارند .                                                                           

  ۴- کشتهایی که ، هم به اکسین ، و هم به سیتوکینین ، نیاز دارند . 

برای گونه هایی که قبلا مطالعه شده ا ند ، در مورد نیاز بافتها یا اندامها ی گیاه مورد نظر ، به تنظیم کننده های رشد در محیط این ویتر ، باید تصمیم گیری شود ، و مقادیر مطلق یا نسبی تنظیم کننده های (اکسین و سیتوکینین ) مورد نیاز ، مشخص شوند .سایر تنظیم کننده ها ، مثل جیبرلین و یا اتیلن مورد نیاز باشند .            

 برای تنظیم کننده های رشد ، از محلولهای ذخیره ، استفاده می شود . برای مثال ، محلول ذخیره  ۱٠٠میلی گرم در لیتر معادل ۱٠ گرم در میلی لیتر ا ست ، و سایر غلظتهای کمتر ، از طریق رقیق کردن، به دست می اید (یک میلی لیتر از این محلول ذخیره در لیتر ، غلظت نهایی ۱٠  گرم در میلی لیتر را دارد ) چنانچه در محیط کشت به مدار بین۵ تا ۱٠٠  میلی گرم در لیتر تنظیم کنندۀ رشد نیاز با شد  ، مستقیما به صورت خشک (جامد ) اضافه خواهد شد ، زیرا نمی توان ان را از محلول ذخیره ، به دست اورد .                                                             

 بعضی ا وقات ، در هنگام حل تنظیم کننده ها در اب ، مشکلاتی پیش می اید . توصیه می شود که  ،،  به صورت نمک پتاسیم که بیشتر محلول است ، به کار روند NAA ﻭIBA، IAA همچنین می توان این سه اکسیژن را به کمک پتاسیم هیدروکسید (پتاس) یا سدیم هیدروکسید (سودسوزآور) ،  ۱/٠ مولار حل می شوند .سیتو کینینها نیز معمولا به کمک KOH  یا NaoH   ، 1/0 مولار حل می شوند.  این ،  در حالی است که جیبرلینها را می توان با تکان دادن شدید[25]  در ا ب حل نمود .                   88

محلولهای ذخیرۀ IAA و کینتین را باید در تاریکی نگهداری کرد ؛ زیرا در نور ، غیر پایدار هستند . در نتیجه،این دو تنظیم کننده در محیط کشت به وسیلۀ نور ، تجزیه می شوند . IBA  ، NAA ، D – 4 و 2 و  BA  (سیتو کینین) در نور پایداری بیشتری دارد . نگهداری طولانی  تنظیم کننده های رشد سبب بروز مشکلات بعدی می شود . به عنوان مثال IAA  در حالت محلول ،بتدریج غیر فعال می شود ، همچنین IAA  براحتی به وسیلۀ انزیمهایی نظیر (پراکسیداز، IAA  اکسیداز ) تجزیه می شود .

اسامی و فرمول تنظیم کننده ها در شکل (۶-۸) اورده شده است ، و در این بخش، فقط توضیحات مختصری، از مهمترین اثرات انها ، داده می شود . 

چنانچه در کشت بافت، از تنظیم کننده های رشد  ، خصوصا اکسین و سیتوکینین ، استفاده شود ؛ گاهی اوقات ، سازگاری[26] (عادت ) پیش می اید . سازگاری ، پدیده ای ا ست که در ان ، در کشت این ویترو (که در ا بتدا به تنظیم کننده برای رشد و یا شکل گیری اندام  ، نیاز دارد ) بعد از مدتی ( چند واکشت( [27] دیگر نیازی به تنظیم کننده ها نداشته و تا به تنظیم کنندۀ کمتری نیاز می باشد . این حالت ، اغلب در کشت کالوس و همچنین در مورد تشکیل جوانه های جانبی گونه Vriesea  تحت تاثیر سیتوکینین ، به وجود می اید . بطور کلی ، سازگاری  ، یک تغییر دایمی نیست ، بطوری که اگر گیاهانی از بافتهای سازگار شده و ریز نمونه ها ایزوله شوند ، این نم.نه ها برای رشد مجدد ، به تنظیم کننده های رشد ، نیاز خواهند داشت . به عبارت دیگر ، تغییرات سازگاری در ماهیت اپی ﮊنتیک  [28]( تغییرات در فعالیت ﮊن در مراحل مختلف رشدی گیاه – تنوع محیطی – اکتسابی ) هستند . با این وجود ، مورگان

( ۱۹۸۶) تئوریی ارائه کرده ا ست که طبق ان ، اعتقاد دارد در بعضعی موارد ، سازگاری توارثی ا ست ، و ماهیت اکتسابی ندارد .                                                                                                                      

به نظر می رسد در بعضی موارد (مثلا تشکیل ساقه های جانبی در خانوادۀ Bromeliaceae ) جداسازی نوک ساقه [29] از یک گیاه بالغ بعد از چند واکشت ، دارای اثر تجدید جوانی[30] ا ست . این تجدید جوا نی به کاهش نیاز مجدد به تنظیم کنندۀ رشد ، منجر می شود ؛ که در هر حال ، با پیر شدن کشت، برگشت  می کند بنابراین، پدیدۀ تجدید جوانی ، تشابهاتی با پدیدۀ سازگاری ، دارد .  

۶-۴-۷-۲-اکسین                                                                                                    

اکسین (IAA  ، IBA  ،NAA ، D – 4 و 2) غالبا به محیط کشت  ، اضافه می شود . اکسین طبیعی IAA  معمولا با غلظت 10- 01/0  میلی گرم در لیتر ، اضافه می شود . اکسینهای مصنوعی  و نسبتا فعا لتر (IAA  ، NAA  وتو، فور - دی ) در غلظت  001/0 تا  ۱۰ میلی گرم در لیتر به کار می روند . در شکل  ۶-۹   اثر غلظتها ی بالای یک اکسین ضعیف (IAA ) با غلظت کم یک اکسین قوی(NAA )  مقایسه شده ا ست . اکسینها  ، معمولا باعث رشد طولی سلول، تورم بافتها ، تقسیم سلولی (تشکیل کالوس ) و تشکیل ریشه های نابجا ، مما نعت از تشکیل شاخه های نابجا و جانبی، و غالبا جنین زایی[31]  در کشتهای سوسپانسیون ، می شوند. در غلظت کم اکسین ، تشکیل ریشه های نابجا ، حالت غالب دارد . در حالی که در غلظت زیاد اکسن ، تشکیل ریشه صورت نمی گیرد ، و تشکیل کالوس اتفاق می افتد . استفاده از تو ، فور-دی  باید حتی ا لمقدور محدود شود زیرا می تواند باعث موتاسیون شود . از طرف دیگر  تو ، فور- دی  می تواند مانع از فتوسنتز شود . این در حالی ا ست که در ا ستفاده از اکسینهایNAA ، IBA و IAA چنین اتفاقی نمی افتد .  در بعضی موارد ، اضافه نمودن اکسین ، سبب تسریع رشد گیا هچه  می شود .پیریک و همکاران (۱۹٨۴) نشان داده اند که  NAA سبب تسریع در ریشه دهی گیا هچه های گزینش شده از خانواده Bromeliaceae  می شود ، که در نتیجۀ ان ، گیا هان ، شروع به رشد می کنند (شکل ۶-۱۰)         

۳-٧-۴-۶- سیتوکینین                                                                                                                

سیتو کینینها غالبا برای تحریک رشد و نمو ، به کار می روند؛ کینیتین، BA ،  2ip وPBA  استفادۀ متداول دارند . این هورمونها ، بوﯾﮊه اگر توام با یک اکسین اضافه شوند (شکل ۱۱-۶) باعث تحریک تقسیم سلولی میشوند . در غلظتهای بالا (۱-۱۰ میلی گرم در لیتر ) باعث تشکیل ساقۀ نابجا می شوند ؛ اما معمولا از تشکیل ریشه مما نعت می شود . انها از طریق کم کردن چیرگی ا نتهایی باعث تحریک تشکیل ساقۀ نا بجا ( شکل ۶-۱۲) و عقب افتادگی پیری، می شوند .                                                                                                                       

۴-٧-۴-۶- جیبر لینها                                                                                                                          

معمولا این گروه از ترکیبات ، در کشت این ویتروی گیاهان عالی ، به کار نمی روند . به نظر می رسد که این مواد در بسیاری موارد ، برای کشت این ویترو ، لازم نیستند . GA₃ بیشتر از همه مورد استفاده قرار می گیرد ، اما باید در نظر داشت که خیلی به حرارت حساس ا ست ، به نحوی که بعد از اتوکلاو کردن ۹۰   درصد از فعالیتهای بیولوﮊیکی ان  ، از بین می رود (وان بوات و همکاران ۱۹٧۱) . بطور کلی ، جیبرلینها در کشت این ویترو  ، باعث رشد طولی میانگره ها و رشد مریستم یا جوانه ها ، می شوند . انها ممکن ا ست باعث شکستن خواب  جنینهای ایزوله شده یا بذرها هم  ، بشوند .جیبرلینها ، معمولا سبب ممانعت از تشکیل ریشۀ نابجا (شکل ۶-۱۳) و همینطور تشکیل ساقۀ نابجا می شوند (پیریک و استیگمنز a۱۹٧۵) .  

    ۵-٧-۴-۶- سایر تنظیم کننده ها                                                                                                            

اولیگوساکارینها                                                                                                                                       

 اخیرا کشف شده ا ست (البرشیم و لارویل ۱۹۸۵؛ البرشیم و همکاران ۱۹۸۶) که اولیگوساکارینها (از نظر ساختمانی ، قطعاتی از پلی ساکاریدهای دیوارۀ سلولی  ، محسوب می شوند .) پیام رسانهای شیمیایی ، با خصوصیات تنظیم کنندگی خاص هستند .اولیگوساکارینها به وسیلۀ  انزیمها   ، از دیواره های سلولی ، ازاد می شوند . اولیگوساکارینهای مختلف، می توانند نه تنها به عنوان سیستم دفاعی گیاه علیه عوامل بیماریزا و سایر انواع تنشها ، بلکه از طریق تنظیم رشد گیاهی و تمایز داخل ریشه ها ، گلها و جوانه های رویشی ، به عنوان تنظیم کننده نیز عمل کنند .   

95

ا سید ا بسیک                                                          

در بسیاری موارد ، کشت این ویترو ABA با اثر منفی مواجه بوده ا ست (پایلت و دولند ۱۹٧۱) (شکل ۶-۱۴) و گزارشهای موجود مبنی بر تحریک رشد کالوس و جنین زایی ان ، احتمالا اتفاقی ا ست (ا میرراتو ۱۹۸۳).