5-4-6- pH

درباره اثر pH‌ محیط کشت روی رشد این ویترو اطلاعات کمی وجود دارد. به نظر می رسد که pH در محدوده 5 تا 5/6 برای رشد، مناسب باشد ؛ زیرا pH های پایین ( کمتر از 5/4) و pH های بالا ( بالاتر از 7) عموما در کشت این ویترو باعث توقف رشد و نمو می شود.

اگر pH خیلی پایین باشد مسائل ذیل ، می تواند به وجود آید ( بوتنکو 1986) :

1-     اکسین IAA ‌ و اسید جیبرلیک کمتر پایدار می ماند.

2-     غلظت آگار کم ( آبکی ) می شود.

3-     احتمال رسول نمکهای خاص (‌نمکهای فسفات و آهن) وجود دارد.

4-     ویتامین B₁ و اسید پانتوتنیک کمتر پایدار می مانند.

5-     جذب یونهای آمونیوم کند می شود.

PH قبل و بعد از اتوکلاو کردن متفاوت است. اگر PH اولیه ، بین 5 تا 7 باشد؛ معمولا حدود 3/0 تا 5/0 واحد پایین می آید ( اسکیروین و همکاران 1986) در منابع کشت بافت گیاهی بندرتاز بافرها برای کنترل PH استفاده شده است. گاهی بافر فسفات سورنسون[18] به کاربرده شده است. در هر صورت کاربرد بافرهای فسفاته در اثراضافه شدن به محیط کشت باعث تغییراتی خواهد شد. انگلیش و حنان ( 1945) گزارش کرده اند که با PH برابر با 6 قسمتی از گلوکز در اثر اتوکلاو کردن به فروکتوز تغییر پیدا می کند. به نظر می رسد که تبدیل ساکارز به گلوکز و فروکتوز طی اتوکلاو کردن با PH مرتبط باشد.

در بعضی موارد از بافرهای MES [19]و TRIS [20] ( بنگا و درزان 1982)  نیز در کشت بافت گیاهی استفاده شده است. تعداد دیگری از بافرها نیز آزمایش شده اند، که به نظر می رسد ( خصوصا آنهایی که توسط گیاه تجزیه می شوند) سمی باشند.

اگر PH در طول کشت بافت گیاهی خیلی کاهش یابد، محیط کشت، رقیق می شود و لازم است محیط کشت تازه با PH‌ مطلوب آماده شود. اغلب کشت بافت خود حالتی بافری را تنظیم می کند بطوری که PH پایین به حد مطلوب می رسد. باید در نظر داشت که PH اولیه برابر 6 در حین رشد ، می تواند تا 5/5 یا کمتر از آن برسد ( اسکیروین و همکاران 1986) .

اگر در حین تهیه محیط کشت ، PH خیلی پایین یا خیلی بالا باشد، می توان بترتیب آن را NaoH یا HCL‌ ( 1 تا 1/0 مولار) رقیق تنظیم کرد.

6-4-6- پتانسیل اسمزی

پتانسیل اسمزی محیط کشت را مجموع پتانسیلهای اسمزی آگار و سایر ترکیبات ( مواد معدنی، قندها و غیره )تشکیل می دهد. محاسبه پتانسیل اسمزی محیط غذایی خیلی پیچیده است و وزن مولکولی نمکها و درجه حلالیت آنها در دو اهمیت دارند. درعمل پتانسیل اسمزی نهایی را فقط از طریق اندازه گیری می توان مشخص کرد. بدون شک قندها در مقایسه با نکهای پر مصرف اثر بیشتری روی پتانسیل اسمزی دارند. باید در نظر داشت که قند دی ساکارید ( مثلا ساکاروز ) توسط اتوکلاو کردن به دو منوساکارید تغییر می کند ( هیدرولیز می شود) و در نتیجه پتانسیل اسمزی را تغییر می دهد.

سهم قندها و نمکهای پر مصرف در وقع پتانسیل اسمزی محیط های کشت مختلف متفاوت است ( یوشیدا و همکاران 1973) پتانسیل اسمزی ( بر حسب بار ، یک بار = 10⁵ پاسکال) نمکهای پر مصرف و قند در چند محیط کشت ، بترتیب به قرار ذیل است:

اگر  پتانسیل اسمزی بیش از حدود  ×۳  پاسکال  (برابر با ۳ بار ) باشد ، رشد و شکل گیری اندام ، براثر توقف جذب اب ، متوقف می شود (پیریک و استیگمانز۱٩٧٥) . پتانسیل اسمزی محیط کشت را تقریبا  می توان بسادگی با افزودن مانیتول٣ افزایش داد . مانیتول ، یک مادۀ غیر فعال فیزیولوﮊیکی است (گرینوود و برلین ١٩٧٣) . افزودن مانیتول[23] ،یک مولار به محیط کشت ،باید در واقع پتانسیل اسمزی٤ /٢٢- بار را حاصل نماید . امروزه از پلی اتیلن گلایکول[24] نیز برای تغییر پتانسیل اسمزی محیط کشت ، استفاده میشود .                                                                                 

7-4-6- تنظیم کننده های رشد                                                                                                                   

///////////////////////////////////////////////////////////

85- محيط كشت مورد استفاده براي كشت پروتوپلاست (كه مواد مورد نيازان بسيار بيشتر از مواد تشكيل دهنده ي محيط كشت قلمه يا كالوس مي باشد) غالبا توسط فيلتر استريل مي شود . هم در هنگام اتوكلاو كردن وهم پس از ان، بايد نكات زير، مورد توجه قرار گيرند:   

1-phمحيط كشت بين 3/. تا 5/. واحد كاهش مي يابد.

2-اتو كلاو كردن در حرارت هاي بالا، باعث قهوه اي شدن (كارامليزاسيون)قندها مي شود ،كه ممكن است اثر سمي داشته باشند.

3-اتوكلاوكردن براي مدت زمان طولاني ، باعث ته نشين شدن نمكها وتجزيه ي اگار، مي شود.

4-در مورد تنظيم دقيق مدت ودما (فشار مؤثر) بايد دقت كافي بشود. نوعي باكتري

(Bacillus stearothermophilis)مي تواند به عنوان شاخص بيولوژيكي، مورد استفاده قرار گيرد(براي اطمينان از صحت عمل استريل)اين باكتريها در مدت 12تا15 دقيقه در دماي 121 درجه سانتي گراد، ازبين مي روند.

 5-بايد در نظر داشت كه مواد فرار، دراثر استفاده از اتوكلاو، ازبين مي روند(مثل اترل واتيلن)

6-اگر نياز به شيبدار بودن سطح محيط كشت باشد(مثلا براي كشت جنين ياكشت بذر اركيده) لوله هاي ازمايش را پس از اتوكلاو كردن، بايد به صورت مايل، قرار داد.

7-توصيه مي شود در اتوكلاو، از اب بدون ملح استفاده شود .چون آب لوله كشي شهرحاوي مقادير زيادي كلسيم است كه در كف اتوكلاو رسوب كرده وتنظيم مسطح آب  وكنترل فشار  را مختل مي كند.

در سالهاي اخير، دستگاهي ساخته شده است كه مقادير مشخص محيط كشت(5/. تا16) ليتررا تهيه واستريل مي كند.در حين استريل كردن ، محيط كشت ،  به هم زده مي شود،كه درنتيجه، حل شدن مواد،   بهتر صورت مي گيرد.به هم زدن همچنين باعث سريعتر گرم شدن محيط كشت، ونهايتا سرد شدن سريعتر ان در انتهاي عمل استريل كردن مي شود.

پس از اتوكلاو كردن،مواد حساس به گرما، اضافه مي شوند،كه براي مخلوط شدن، بايد مجددا به هم زده شوند.

محيط كشت استريل شده در داخل اتاقك تميز، به لوله هاي ازمايش ،فلاسكها وظروف مشابه، منتقل مي گردد.امروزه دستگاههاي اتوماتيك تهيه واستريل كردن محيط كشت وجود دارند.

3-3-5-استريل كردن باتابش:

استريل نمودن محيط كشت توسط تابش(بااشعه ي گاما)بندرت در كشت بافت، مورد استفاده قرار

مي گيرد.زيرا در مقايسه با اتوكلاوكردن، هزينه ي بسيار بالاتري دربردارد. به نظر مي رسد اگر چه اشعه ي گاما، بخوبي اتوكلاو، عمل استريل را انجام مي دهدولي رشد گياهان درمحيط استريل شده با اشعه ي گاما، كاهش معني داري نشان مي دهد.جهت توضيحات بيشتر به كتابچه ي راهنماي استريل كردن نوشته ي فن براكت(1971)مراجعه شود.

در مورد ظروف ، جعبه هاولوله هاي پلاستيكي كه امكان استريل شدن انها با اتوكلاو وجود ندارد از اشعه ي گاما استفاده مي شود.سپس محيط كشت استريل شده در داخل اتاقك تميز،به ظروف استريل، انتقال مي يابد.  

4-3-5-استريل كردن با فيلتر:

در استريل كردن با فيلتر(محلولها،محيطهاي كشت مايع وغيره،از يك غشا، عبورداده مي شوند) كليه ي ذرات ميكروارگانيزمها وويروسهايي كه بزرگتراز قطر منافذ فيلتر هستند،حذف مي شوند. مهمترين مزيت اين روش،عبور مواد حساس به گرما(موادي كه در اثر اتوكلاو كردن تجزيه مي شوند)از فيلتر مي باشد،بدون اينكه تغييري در انها ايجاد شود.معايب اين روش عبارت است از :جذب موادتوسط فيلتر،عبور احتمالي برخي از ويروسها،وقت گير بودن وسهل نبودن كاربرد ان،نسبت به روش اتوكلاو.همه ي مشكلات اين روش در كتابچه ي فن براكت وهمكاران (1971)آورده شده است. استريل كردن با فيلتر غالبا زماني استفاده مي شود،كه نياز به يك ماده ي حساس به گرما (x)درمحيط كشت باشد. استفاده ازفيلتري باجنس استات سلولز،يا نيترات سلولز، با منافذي به قطر 22/.ميكرون،توصيه مي شود. محيطهاي كشت بدونx(ماده ي حساس به گرما)ابتدا داخل يك فلاسك، اتوكلاو مي شوندودر

حاليكه هنوز مايع هستند(دماي بين 40 تا 45درجه ي سانتي گراد)،مايعي كه حاوي ماده ي x مي باشد، توسط يك سرنگ زير پوستي كه مناسب با غشاي فيلتر است،تزريق مي شود.(اين اعمال ،در داخل اتاقك تميز، انجام مي گيرند).محيط كشت حاوي ماده ي xسپس به هم زده شده ومحيط كشت كاملي كه به اين ترتيب حاصل شده است به لوله هاي استريل شده منتقل مي گردد.امكان عبور دادن محيط كشت كامل حاوي  x نيزاز فيلتر وجود دارد.براي انجام اين عمل قبلايك پمپ خلا به فيلترهاي استريل كننده متصل مي شد.مايع تحت نيروي خلا، از يك غشا عبور كرده، و به داخل فلاسك بوخنر هدايت مي گرديدوسپس خلا توسط يك پمپ تنفسي ايجاد مي شد.امروزه محلول مورد نظر،بافشار،از فيلتر گذرانده مي شود وفشار لازم توسط فشار هوا يا سرنگ تامين مي شود.

بديهي است قسمتهاي مختلف فيلتر(گيره،صافي،سوزن وغيره)بايد قبل از استفاده، توسط اتوكلاو يا الكل96درصد،استريل شوند.

در استريل كردن با فيلتر،امكان بروز مشكلاتي وجود دارد.مثلا اگر غلظت نهايي 10 ميلي گرم در ليتربراي ماده ي Xمورد نياز باشد (از يك محلول استوك با غلظت 1000)وحلاليت ماده ي Xدر اب زياد نباشد،مشكلاتي پيش مي آيد.در اين مورد، يك ميلي ليتر از محلول استريل صاف شده حاوي 10هزار ميلي گرم در ليتر ماده ي  Xبايد به 1000ميلي ليتر از محيط كشت، اضافه شود.اين كار،به دليل عدم حلاليت ماده ي Xدرآب،امكان پذير نيست.لذا ده ميلي گرم از ماده ي Xپس از توزين، داخل اتر استريل شده وپس از بخار شدن اتر، به محيط كشت استريل، اضافه مي شود.