فصل اول

 

 پیش گفتار

 

از سال 1975 کشت این ویتروی گیاهان عالی، پیشرفت قابل توجهی نموده است و بدلیل گسترش اطلاعات بشر از فرایندهای بیولوژیکی و به کارگیری این اطلاعات در برنامه‌های به نژادی در تولید اغلب گیاهان زراعی حاصل شده است و همواره نیاز به تولید بیشتر وجود دارد. اصلاح ژنتیکی گیاهان به روش معمول در مواردی با موانعی مواجه بوده و یا پیشرفت آن چندان سریع نبوده است.

لذا بکارگیری روش‌های نوین از قبیل کشت بافت‌های گیاهی می‌تواند بعضی از موانع را مرتفع نماید. بطور مثال با استفاده از تکنیک می‌توان هاپلوئیدهای مضاعف، امتزاج پروتوپلاسم به منظور تولید هیبریدهای غیرجنسی، ازدیاد سریع گونه‌هایی که امکان تکثیر آنها به روش معمول با مشکل مواجه است، نجات جنین برای انجام تلاقی‌های بین گونه‌ای، به گزینی سریع و آزمایشگاهی برای عکس‌العمل به تنش‌های حیاتی و غیرحیاتی و غیره را انجام داد.  روش‌های آزمایشگاهی برای کشت گیاه، بذر، جنین، جوانه‌ی ساقه، مریستم، بافت، سلول و پروتوپلاست، در محیط کشت استریل، ابداع شده است. این روش‌ها باعث شده است که با بهره‌گیری از آنها، بتوان باززایی و تولید را در بسیاری از گونه‌های گیاهی، انجام داد. از سال 1980 پیشرفت‌های خارق العاده‌ای در تکنیک‌های بیوتکنولوژی و دستکاری‌های ژنتیکی، حاصل شده است.

 

1- مقدمه

1-2-کلیات

وقتی در باره‌ی کشت گیاه صحبت می‌شود؛ معمولا ً منظور، کشت گیاهان در: گلدان، زیر پلاستیک، در گلخانه، و یا مزرعه است. در تقسیم‌بندی‌های رایج در کشاورزی، کشت گیاهان، به بخش‌های مختلف شامل: زراعت، باغبانی، زراعت مناطق گرمسیری، جنگلداری، و اصلاح نباتات، تقسیم می‌گردد. در سال 1904 هانیگ روش جدیدی از کشت گیاهان، بنام کشت جنین را ارئه نمود. او، جنین نابالغ تعداد زیادی از گیاهان کروسیفره ها را در شرایط ویترو (کشت آزمایشگاهی) ایزوله کرد، از آنها، گیاهچه‌های زنده، به دست آورد. از سال 1920 انواع روش‌های کشت، نظیر: کاشت این ویترو بذور ارکیده، کشت کالوس، کشت اندام، و امثال آن، مرسوم شد. بعد از سال 1945، به تمام روش‌های مختلف کشت، کشت بافت گیاهی اطلاق شد. برای اجتناب از سردرگمی، نام این کتاب نیز کشت گیاهان عالی، به روش این ویترو انتخاب شده است. دلیل این نامگذاری، توضیحات درباره‌ی: کشت گیاهان، بذور، جنین، اندام، قلمه، بافت، سلول، و پروتوپلاست‌های گیاهان عالی، در محیط کشت استریل (ضدعفونی شده) است. این روش‌ها دارای مشخصات زیر، می‌باشند.

1-هر کدام از این روش‌ها، در مقیاس کوچک، یعنی در یک سطح کم وسعت، انجام می‌شوند.

2-شرایط محیط‌های مناسب آنها، با توجه به عوامل فیزیکی و غذایی و هورمونی، انتخاب می‌شوند.

3-از تمام موجودات ذره بینی (قارچ‌ها، باکتری‌ها، ویروس‌ها) و همین طورسایر آفات گیاهان عالی (حشرات، نماتدها) عاری می‌باشد.

4-الگوی معمول نمو گیاه، معمولا ً از بین رفته و یک بافت ایزوله شده می‌تواند تولید کالوس کرده و یا این که به راه‌های غیرمعمول (نظیر تشکیل اندام ، جنین سوماتیکی) رشد کند.

5- توانایی رشد پروتوپلاست‌ها ویا تک سلول‌ها، امکان دست‌ورزی را که قبلا ً نا ممکن بود، مقدور می‌سازد.

6-انتخاب نام کشت این ویترو (این ویترو از نظر لغوی، یعنی درون شیشه‌ای یا آزمایشگاهی) به دلیل این است که حداقل در آغاز استفاده از این روش‌ها، لوله‌های شیشه‌ای، برای کاشت، به کار رفته است.

از آنجا که این کتاب، توصیف کاملی از روش‌های مختلف کشت این ویترو را در بر می‌گیرد (شکل1-2)، می‌تواند به عنوان یک دستور کار‌، برای روش‌های کاشت این ویترو، استفاده شود.

جنبه‌های روش‌شناسی این ویترو، در فصول 5 تا 14 آورده می‌شود.

مباحث مطرح شده در این فصول‌، عبارت است از: آماده نمودن لوازم آزمایشگاهی، آماده سازی کشت، نحوه‌ی بستن لوله‌های آزمایش و فلاسک‌ها، رشد و نحوه‌ی کاشت و استریل کردن مواد گیاهی‌، جداسازی‌، کاشت و واکاشت‌، مکانیزه‌کردن، تأثیر مواد اولیه، و عوامل فیزیکی روی رشد و نمو، و غیره.

کاشت این ویترو، ابزار مناسبی برای رسیدن به هدف‌های ناممکن است که در شرایط این ویوو (کشت در محیط طبیعی) وجود دارد.

در فصول 16 تا 25  مجددا ً به جنبه‌های عملی کشت این ویترو پرداخته می‌شود، و دلیل به کارگیری آن، مطرح خواهد شد در این فصل، به جنبه‌های کاربردی آن، در: کشاورزی، باغبانی، جنگلداری، و همچنین تحقیقات پایه می‌پردازیم.

در زیر لیستی ازانواع مختلف کشت و امکان کاربرد آنها، به همراه فصول مربوطه (در داخل پرانتز) آورده شده است. اصطلاحات فنی به کار رفته در جدول، درقسمت 2-2 تعریف گردیده است. جزئیات مربوط به هر نوع کشت و کاربرد عملی آن، در فصول مربوطه، بررسی می‌شود.

 

 

 

هدف	نوع کشت
کوتاه کردن دوره ی اصلاحی                                                                    جلوگیری از سقط جنین، غلبه کردن بر ناسازگاری،تولید هاپلوئید،منبعی برای تولیدکالوس	کشت جنین(16)
کوتاه کردن دوره ی اصلاحی جای گزین کردن هم زیستی (میکوریزا)،ازبین بردن رقابت باسایرمیکروارگانیزمها	کشت بذر ارکیده(17)
حذف پاتوژنها(ویروسها،قارچها،باکتریها)، تکثیررویشی ارکیده از طریق پروتوکورم، ذخیره کردن گیاهان عاری از ویروس، انتقال عاری از بیماری،جمع آوری ژرم پلاسم	کشت مریستم(18-19)

 

 

تکثیر ارکیده،شاخه دهی محوری ، به عنوان وسیله ای جهت تکثیر گیاهان ، حفاظت مواد در بانک ژن.	کشت نوک ساقه و تک جوانه (18-20)
تشکیل اندام های نابجا،برای تکثیر گیاهان،به دست آوردن گیاهان عاری از ویروس، تولید موتانت،ایزوله کردن موتانتها، حل مشکل شیمر، به دست آوردن پلی پلوئیدی.	کشت قلمه بدون جوانه های ابتدای (19-20-25)
تکثیرغیرجنسی گیاهان از طریق تشکیل اندام و جنین، ایجاد واریانتهای ژنتیکی ، به دست آوردن گیاهان عاری از ویروس،به عنوان منبعی جهت تولید پروتوپلاست،تولید مواد اولیه برای نگه داری دربانک ژن با روش استفاده از ازت مایع،تولید متابولیتهای ثانویه، انتقال زیستی.	کشت کالوس، سوسپانسون
تولید گیاهان هاپلوئید،و بدست آوردن انواع هموزیگوت،به عنوان نقطه ی شروع برای القای موتاسون،تولید گیاهان کاملا ً نر،به عنوان وسیله ای جهت دست ورزی ژنتیکی، برای اصلاح در سطوح پایین پلوئیدی.	کشت پرچم و میکروسپور(23)
غلبه بر ناسازگاری ،حفاظت ازریزش پیش از موعد گلها، تلقیح در لوله ی آزمایش. دورگ گیری غیر جنسی ، به وجود آوردن سیبرید ،  جابه جایی ها( قطعاتی از کروموزومهاواندامها)، مطالعات انتقال یا ترانسفورماسیون،ایجاد واریانتهای ژنتیکی.	کشت تخمک و گلهای جدا شده (16-22)  کشت پروتوپلاست
وسیله ای در تحقیقات فیتوپاتولوژی نفوذ و نسخه برداری ویروسها،کشت پارازیتهای اجباری ، کشت نماتدها،کشت ریشه(جدا شده)، آزمون فیتوتوکسینها،تحقیقات مربوط به گره زایی ، مطالعات مربوط به سیکل سلول ، متابولیزم ، تغذیه ای ، مورفوژنتیکی و مطالعات مربوط به مراحل نمو آن.	کشت پروتوپلاست سلولها بافتهاو اندامها(25)

 

چون نتایج کشت این ویترو دارای اهمیت زیادی در کشاورزی ، باغبانی و جنگلداری است ، در این کتاب تکثیر رویشی به این روش، همراه با جزئیات آن ، مورد بررسی قرار خواهد گرفت. استفاده از این روش ، بویژه در باغبانی ، قابل توجه می باشد ، چون نتایج آن سریعا ً در اختیار مردم قرار می گیرد. قابل ذکر است که متخصصین باغبانی نیز، از کشت این ویترو،غالبا ًبه عنوان وسیله ای جهت تکثیر رویشی استفاده می کنند. از آن جا که کشت بافت ، صرفه جویی زیادی در فضا (گلخانه) و در نتیجه در انرژی به وجود آورده ، سبب شده است که بطور مؤثری تغییرات قابل ملاحظه ای را در روند تولید گیاهانی که به طور تکثیر رویشی تولید می شوند ، به وجود آورد. این موضوع در بخش 2-3 و فصل 26 بیان شده است.

 

علاوه برکاربرد عملی این تکنیک ،کشت سلول گیاهی ، بافت و اندام، نقش زیادی را در بهبود آگاهی ما ، در رابطه با مبانی علم سلولی ، داشته است. تئوری سلولی شوان و شلیدان(39-1838)که در آن ، سلول به عنوان کوچکترین واحد بیولوژیکی در نظر گرفته شده است و می تواند به عنوان تولید کننده ی یک اندام در نظر گرفته شود ، از طریق کشت بافت ، به اثبات رسیده است ، بطوری که یک سلول ساده ، می تواند یک گیاه کامل را تولید نماید(خاصیت توتیپوتنسی سلول)

بعد از جدا سازی موفقیت آمیر پروتوپلاست زنده ، که از آن ، گیاه کامل ، قابل تولید بود ؛ این روش به عنوان ابزار جایگزینی (دو رگ گیری غیرجنسی یا دو رگ گیری سوماتیک) برای روشهای تکثیر متداول ، به کار گرفته شد. امکان تشکیل یک موجود بعد از امتزاج پروتوپلاست ، به این معنی که به طور کلی می توان بر موانع ژنتیکی طبیعی غلبه کرد. دورگ گیری سوماتیکی ، امکان تولید هیبریدهای سیتوپلاسمی (سیبریدها) را ممکن می سازد. تکنیکهایی مثل جابه جایی هسته ها یا (قسمتی از) کروموزومها و اندامکها به وسیله ی متخصصین ژنتیک ، اصلاح نباتات و بیولوژی مولکولی ، مورد بررسی قرار گرفته است. در حال حاضر،کشت سلول ، دارای اهمیتی خاص دربیوتکنولوژی است و متخصصین در حال تلاش جهت رشد سلولهای گیاهی ، مشابه آنچه در مورد میکروارگانیزمها انجام می شود ، به منظور به دست آوردن فراورده های صنعتی از متابولیتهای ثانویه هستند.

 

 

2-2-مخففها و فهرست معانی

ABA                        اسید ابسسیک

BA                          6-بنریل آمینوپورین

C                             درجه ی سلسیوس

CCC                       (2،کلرواتیل)تری متیل آمونیوم کلرید

2.4-D                      2،4-دی کلرو فنیل استیک اسید

DMSO                    دی متیل سولفوکسید

DNA                       دزوکسی ریبونوکلئیک اسید

EDTA                     اتیل دی آمین تترایتات

ELISA                    آزمون الایزا

GA                         اسید جیبرلیک

IAA                       ایندول -3-اسید استیک

IBA                       ایندول-3-اسید بوتیریک

2IP                        6-(γ،γ-دی متیل آلیل آمینو)پورین

MS                        محیط کشت موراشی و اسکوگ(1962)

NAA                     α-نفتالین اسید استیک

PBA                      6-(بنزیل آمینو) -9-(2،تتراهیدروپیرانیل)

                              -H9- پورین

PEG                      پولی اتیلن گلایکول

PVP                      پولی وینیل پیر... لیدون

RNA                     ریبو نوکلئیک اسید

TIBI                     2،3،5-تری یدو بنزوییک اسید

UV                      ماورای بنفش(نور)

V/V                     حجم/حجم (غلظت )

W                        وات

W/V                    ورن/حجم (غلظت )

زآتین                    6-(4-هدروکسی-3-متیل-2-بوتیل آمینو)پورین

Abscisic acid : به صورت ABA نوشته می شود. هورمون گیاهی است که در ارتباط با خواب بذر و پیری گیاه ، نقش دارد.

Adventitous  : نمو اندامها (ریشه ها ، جوانه ها،شاخه ها،گلها و غیره) یا جنینها (ساختمانهایی شبیه جنین)از نقاط غیر معمولی ،از جمله کالوس (شکل2-2). اگر اندامها از آغازیهای اندام ، پریموردیای اندام ، یا جنینهای نمو یافته از تخمها رشد کنند این واژه نمیتواند بکار رود.

Agar  :  یک محصول گیاهی (ساخته شده از جلبک) که برای جامد کردن محیط کشت ، بکار می رود.

Alcohol  :  اتیل الکل (C2 H5 OH) ، اتانول هم نامیده میشود.

Amino acids  :  آمینو اسید

Androgenesis  :  پارتنوژتز نر-تولیدگیاه هاپلوئید ازدانه ی گردو

Aneuploid  :  آنیوپلوئید-سلولی که در آن ، تعداد کروموزومها در x (تعداد هاپلوئید) یا مضرب x ، انحراف داشته باشد.

Anti-oxidants  :  یک گروه از مواد شیمیایی که از اکسیداسیون جلوگیری می کنند، مثل ویتامین c ، اسید سیتریک.

Antisepsis  :  فرایند یا اصول استفاده از آنتی سپتیکها

Antiseptic  :  آنتی سپتیک-جلوگیری از رشد میکرو-ارگانیزمها

Apical dominance  :  غالبیت انتهایی-حالتی از جوانه ی انتهایی شاخه ، رشد نموده ، و جوانه های جانبی را تحت الشعاع قرارمیدهد.

Apical meristem  :  گروهی از سلولهای مریستمی انتهای ریشه یا ساقه ، که با تقسیم سلولی پیش سازهای بافتهای اولیه ، ریشه و ساقه را به وجود می آورند.

Apomixes  :  آپومیکسی-جای گزینی تولید مثل جنسی به وسیله ی روشهای مختلف تولید مثل غیر جنسی ، که درآن ، هیچ گونه امتزاج گامتی ، اتفاق نمی افتد.

Asepsis  :  عاری از میکرو-ارگانیزمها

Aseptic  :  عاری از میکرو-ارگانیزمها(قارچ،باکتری،مخمرها، ویروسها،میکوپلاسماها،و غیره)،استریل (عقیم)

Asymbiotic  :  غیرهمزیست بامیکرو-ارگانیزمها.واژه symbiosis را ملاحظه نمایید.

Autoclave  :  اتوکلاو-ظرفی که درآن: محیط کشت ، ظروف شیشه ای و غیره به وسیله ی بخار تحت فشار، استریل می گردند.

Auto trophic  :  بدون نیاز به مواد آلی.   

Auxins  : اکسین – گروهی از هورمونهای گیاهی ( طبیعی یا مصنوعی ) که باعث رشد طولی سلولی ؛ یا در بعضی موارد ، تقسیم سلولی می شود ؛ غالبا باعث ایجاد ریشه های نابجا ، و مانع جوانه های بابجا ( شاخه ها ) می شود .

Axenic : جدا شده از سایر ارگانیزمها ( موجودات زنده ) .

Axillary : منشأ گرفته از محور برگها

Binocular : استریو میکروسکوپ ، با بزرگ نمایی بین 5 تا 20 برابر .

Biosynthesis: سنتز ترکیبات به وسیله گیاه و سلولها

Callus: کالوس – توده سلولی تمایز نیافته ، که غالبا از آسیب ( زخم ) یا از طریق کشت بافت به دست می آید .

Cambim: کامبیوم – بافتهای در حال تقسیم ، که در ساقه ، چوب و تنه درخت را می سازد .

Carbohydrates: کربوهیدارتها – گروهی از ترکیبا به عنوان منبع انرژی عمل می کنند ( مثل گلوکز ، ساکارز ، فروکتوز و غیره )

Casin hydrolysate: مخلوطی از ترکیبات ( خصوصا اسیدهای آمینه ) ساخته شده از کازیین.

Cell culture: کشت سلول – رشد سلولها در محیط ویترو .

Cell generation time : فاصله زمانی بین تقسیمات سلولی متوالی

Cell line: سلولهای حاصل از کشت اولیه ، که برای بار دوم و سوم و ... کشت شده اند .

Chimera : شیمر – گیاهی که محتوی گروهایی ( لایه هایی ) از سلولهایی است ، که از نظر ژنتیکی شبیه هم نیستند .

Clone  : کلون – گروهی از سلولها ، بافتها یا گیاهانی که اساسا از نظر ژنتیکی شبیه هم هستند یک کلون ، الزاما متجانس نیست .

Coconut milk : شیر نارگیل – مایع اندوسپرمی نارگیل .

Contaminant  : آلوده کننده – میکرو ارگانیزم .

Culture room : اتاق کشت – که در آن نور ، حرارت و رطوبت ، کنتر می شود .

 

Cybrid : سیبرید – هیبرید سیتوپلاسمی ، که از امتزاج سیتوپلاست ( سیتوپلاسم بدون هسته ) با یک سلول کامل ، منشأ می گیرد .

Cytokinins: سیتوکینین – یک گروه از هرومونهای گیاهی ( طبیعی یا مصنوعی ) که باعث تقسیم سلولی ، و اغلب تشکیل جوانه های نابجا ( شاخه ها ) می شود ؛ و در بسیاری موارد ، مانع تشکیل ریشه می شوند ؛ سیتوکینینها ، غالب انتهایی را کاهش می دهند .

Dedifferentiation of cells : برگشت ( تبدیل ) سلولهای مریستمی ) تمایز یافته به سلولهای غیر متمایز .

Deionized water : آب فاقد ترکیبات معدنی .

Detergent : ماده ای که کشش سطحی محلول را کم می کند ، و به منظور بهبود تماس گیاه و ماده استریل کننده ، اضافه می شود .

Development : نمو – گذران سیکل از بذر تا بذر ، یا از شروع تشکیل اندام تا پیری آن ؛ و یا تغییرات در شکل یک گیاه به وسیله رشد و تمایز .

Differentiation : تمایز – نمو سلولها یا بافتهای با فعالیت خاص ، و یا باز زایی اندامها یا ساختمانهایی ( تشکیلاتی ) شبیه اندام ( ریشه ها ، ساقه ها و غیره ) یا ( پیش ) جنینها .

Differentiation of cells : سلولهایی که یک فعالیت خاص را بر عهده بگیرند .

Dihaploid : فرد حاصل از ( مشخص شده با x2 = n2 ) موجود تتراپلویید ( x4=n2) ( هرمز ، 1977).

Diplophase : فاز با n2 کروموزوم پایه باشد

Diploid : دیپلویید . گفته می شود که حاوی دو برابر کروموزوم پایه باشد ( هرمز 1977) . فرمول زنومی x2=n2

Disease – free : خالی از بیماری .

Disease – indexing : گیاهان شاخص بیماری که الز آنها برای تشخیص بیماریهای شناخته شده ، با توجه به روشهای آزمون استاندارد ، استفاده می شود .

Disinfection : از بین بردن میکرو ارگانیزمها .

Distilled water : آب مقطر – آب حاصل از تقطیر ، که حاوی هیچ گونه ترکیبات آلی یا غیر آلی نباشد .

Doubling time : واژه بکار برده شده در کشت قافت ، که زمان مورد لزوم برای دو برابر کردن تعداد سلولها در این ویترو ، می باشد .

EDTA : اتیلین دی آمین تترا استیک اسید ، که یک ترکیب شلاته ، که در آن ، آهن ، علی رغم متصل بودن شدید ، قابل استفاده گیاه است .

Embryo abortion  : مرگ جنین ( سقط جنین )

Embryogenesis : جنین زایی – فرآیندی که طی آن ، جنین از سلول تحم بارور ، یا گروهی از سلولهای غیر جنسی ، به وجود می آید .

Embryoid : قلمه – ساختار شبیه جنین که توسط سلولهای سوماتیکی به ورش این ویترو ، تولیدمی وشد . به جنین نابجای حاصل از رویش در محیط این ویترو نیز اطلاق می شود .

Embryo culture : کشت جنین ، روی محیط کشت .

Endomitosis دو برابر شدن تعداد کروموزومها بدون تقسیم هسته ف که منج به پلی پلوییدی می شود .

Endopoly ploidy : تولید سلولهای پلی پلوییدی در نتیجه اندومیتوز.

Epigenetic variation : تنوع غیر توارثی ، که در هر زمان قابل برگشت است .

Erlenmayer flask : فلاسک ته صاف مخروطی شکل ( ارلن مایر )

Exice : قطع ( با چاقو ، چاقوی جراحی و غیره ) و آماده کردن بافت ، اندام و غیره ، برای کشت .

Filter sterilization : مرحله استریلیزه کردن مایع ، از طریق عبور از صافی با سوراخهای بسیار ریز، که غیر قابل عبور میکروارگانیزمها باشد

Flaming : گرفتن روی شعله ، به عنوان تکنیکی برای استریلیزه کردن وسایل بعد از فرو بردندر الکل.

Gibberellins : جیبرلینها – گروهی از هورمونهای گیاهی ، که باعث رشد طولی سلول و تقسیم آن می شود .

Growth room: اتاق رشد – culture room را ملاحظه نمایید .

Habituation : عادت نمودن – حالتی که بعد از چند بار و اکشت ، سلولها بدون افزایش هورمونها ، می توانند رشد کنند ، البته در ابتدا ف این هورومونها ضروری بوده اند .

Haploid induction : القای هاپلوییدی – تحریک طبیعی گامتهای نر و ماده ( بعد از میوز ) برای رشد اتوماتیک ( خودبخود )( هرمز 1977 )

Haploid plant : گیاه هاپلویید – گیاهی با نصف کروموزم ( n  ) به دلیل کاهش تقسیم سلولی دیپلویید (  n2=) ( دی فوسارد ، 1976).

Hardening off : تطابق تدریجی گیاهان حاصل از روش این ویترو در شرایط این ویوو ( مثلا کاهش تدریجی رطوبت )

Heterokaryon : هتروکاریون – سلولی با دو هسته یا هسته ای بیشتر ، به دلیل امتزاج سلولی .

Heterotrophic : هتروتروف- نیازمند به مواد آلی .

Homokaryon : سلولی با دو هسته یا هسته های متعدد مشخص ، به دلیل امتزاج سلولی .

Hormone : هورمون – ماده آلی که در داخل گیاه در غلظت کم تولید می شود ، و معمولا در مکانی غیر از مکان تولید خود ، باعث تحریک ، ممانعت و تغییر کیی رشد ، می شود .

Hybridization of cells : هیبریداسیون سلولها – آمیختگی دو یا چند سلول متفاوت ، که به تشکیل سلول هیبید ، منجر می گردد .

Induction : القای شروع یک فرایند خاص ، که نتیجه آن ، نمو اندامهاست ( مثل ریشه ها ، شاخه ها ، گلها )

Infection : آلودگی – انتقال بیماری توسط میکرو ارگانیزمها .

Initial : آغازین ، گروهی از سلولها که به عنوان پیش ساز یک اندام عمل می کنند ( برگ ، ریشه ، جوانه )

Initiation: تشکیل یک ساختمان یا یک اندام ف مثلا پریموردیای ریشه یا ساقه .

Inoculation: تلقیح ، قرار دادن نمونه در داخل یا روی محیط کشت .

Inoculation cabinet: محفظه کوچک برای انتقال نمونه به محیط کشت ، که غالبا همراه با جریان هوای استریل است .

Intercalary: حد واسط بین دو جوانه کنار هم روی یک شاخه ، داخل یک میانگره .

Intergeneric: تلاقی بین دو جنس مختلف .

Interspacific: تلاقی بین دو گونه مختلف .

Juvenile phase: دوره ای از زندگی گیاه ، که در آن ، گل دهی ، اتفاق نمی افتد .در طول ایند وره ، گیاه غالبا خصوصیات کمیابی دارد ( مورفولوژی ، فیزیولوژی و ... ) که با مرحله بلوغ ، متفاوت است .

Laminar air – flow- cabinet : محفظه مخصوصی که در آن ، نمونه را به محیط کشت منتقل می کنند در اینمحفظه هوای استریل در جریان است   .

Leaf primodia: پریمودیای برگ

Liquid media: محیط کشت .

Macro – elements: عناصر ضروری پرنیاز مثل Ca ,K ,P , n و Mg که معمولا در مقادیر نسبتا زیاد مورد لزوم می باشند .

Magnetic stirrer: بهمزن مغناطیسی است که روی آن ، صفحه گرمی قرار دارد . نمونه را در داخل بشر قرار داده ودستگاه ضمن گرم کردن ، از طریق مغناطیسی آن را نیز به هم می زند .

Malt extract: مخلوطی از ترکیبات مالت .

Medium: محیط کشت – nutrient medium را ملاحظه نمایید .

Membraine filter : فیلتر غشایی – برای استفاده در استریل کردن از طریق به کارگیری فیلتر .

Mericlone: یک کلون ارکیده ، که از یک مریستم یا اندام های جدا شده دیگر به روش این ویترو به وجود آمده باشد .

Meristem: مریستم – گروهی از سلولهای در حال تقسیم در نوک ریشه ، شاخه ( مریستم انتهایی ) ، در کامبیوم بین گره ای جوانه ها ، برگها ، وگلها .

Meristemoid: بافت متورم غیر متمایز ، که از آن سلولهای جدید یا ساختمانهای نابجا ( مثل مریستمها ) به وجودمی آید .

Micro – elements: ریز عناصر – گروهی از عناصر مثل Mn , Zn , Mo , B , Fe  و ... ، در مقادیر نسبتا کمی بعنوان مواد غذایی غیر آلی گیاهان مورد استفاده هستند .

Micropropagation: ازدیاد رویشی گیاهان در شرایط ویترو .

Monolayer: تک لایه ای از سلولهای روییده روی یک سطح .

Monoploid: یک سلول یا فرد ، که فقط ژنوم موجود دارد ( x = n2) . مونوپلویید ، از دیپلویید ( x2 = n2) به وجود می آید ( هرمز،1977) و دارای کمترین تعداد کروموزوم در سری پلی پلوییدی است ( دی فوسارد 1976)

Mutation: موتاسیون – تغییر ژنتیکی .

 

Mycorrhiza: میکوریزا – ارتباط قارها با ریشه گیاه عالی .

N or n : تعداد کروموزومها در مرحله هاپلوئید(گامتوفیت )

Nucellar embryo : جنین رشد یافته از بافت سوماتیک ، که اطراف کیسه جنین را احاطه می کند ( بجای لقاح سلول تخم ).

Nutrient medium: محیط کشت – مخلوطی از مواد ، که سلولها ، بافتها و اندامها می توانند با آگار یا بدون آگار ، روی آن و یا داخل آن رشد کنند .

Organ: اندام – قسمتی از گیاه با وظیفه خاص ، مثلا ریشه ، ساقه ، برگ ف گل ، میوه و غیره .

Organ culture: کشت یک اندام به روش این ویترو ، به نحوی که امکان تولید و یا حفاظت از اندام ایزوله شده اصلی ، وجود داشته باشد .

Organogenesis (organ formation): اندام زایی ، تشکیل ریشه ، ساقه ، جوانه ، گل ، شاخه و غیره .

Osmotic potential: پتانسیل اسمزی – پتانسیل حاصل از حلالیت یک ماده در آب ؛ 1 مول گلوکز در یک لیتر اب پتانسیل اسمزی 4/22 آتمسفر را تولیدمی کند .

Parthenogenesis: پارتنوژنز- تولید یک جنین از گامت ماده ، بدون مسارکت گامت نر( دی فوسارد 1976 )

Pathoge – free: بدون عامل بیماری – گیاه ، مریستم ، بافت یا سلولی که عاری از بیماری است ( باکتری ، قارچ ، ویروس و غیره )

Petri dish: پتری دیش یا ظرف مسطح گرد ساخته شده از شیشه یا مواد مصنوعی که دارای سرپوش است .

pH : لگاریتم منفی غلظت یونهای هیدروژن .

Plating efficiency: راندمان یا درصد سلولهای کشت شده که به کلینیکهای سلولی ف منجر می شوند .

Poly embryony: وقتی که دو یا چند جنین ، بعد از لقاح تشکیل می شوند . ( دی فوسارد 1976 )

Polyhaploid: پلی هاپلویید – گیاهی با نصف تعداد کروموزمهای گیاه پلی پلویید .

Polyploid: پلی پلویید – گیاهی ، پلی پلویید است که x3 = n2 ( تری پلویید ) ، x4=  n2 ( تتراپلویید و غیره باشد . تعداد کروموزومهای آن ، مضربی از تعداد کروموزوم پایه (x) است ( دی فوسارد 1976 ؛ هرمز 1977)

Primary culture: کشت حاصل از سلولها ، بافتها و اندامهای حاصل شده از یک ارگانیزم .

Primordium: گروهی از سلولها ، که به یک اندام تبدیل می شوند .

Protocorn: ساختار شبه غده ای ، که از بذور جوانه زده ارکیده ، یا در موقع کشت مریستم ارکیده ، تشکیل می شود .

Protoplast: پروتوپلاست – سلول گیاهی بدون دیواره سلولی ، در نتیجه ز بین بردن آنزیمی دیواره سلولی .

Regulator: ماده تنظیم کننده رشد و نمو سلولهای گیاهی ، بافتها و غیره .

Rejuvenation: جوانه سازی – برگشت از حالت پیری به جوانی .

Rotary shaker : بهمزن دوار ، که روی آن ظروف حاوی محیط کشت مایع ، تکانداده می شود .

Scalpel: چاقوی جراحی تیز ، کوچک .

Shoot tip : نوک شاخه ( انتهایی ) یا مریستم انتهایی ساقه ، با تعدادی پریموردیای برگ .

Single – node culture: کشت جوانه های جداگانه ، که هرکدام ، حاوی قطعه ای از بافت ساقه است .

Salid media : محیط کشت جامد ، مثلا با آگار .

Somaclonal variation : تنوع سوماکلونال – افزایش تغییرات ژنتیکی در گیاهان عالی که در کشت این ویترو اتفاق می افتد .

Somatic – hybridization: هیبرایداسیون سوماتیکی – هیبریداسیون .

Sphaeroblast: گرهک چوب که می تواند شاخه های بابجای جوان تولید کند .

Stereo,icroscope : استریو میکروسکپ – دو چشم ( bincular) را ملاحظه نمایید .

Sterile:استریل – محیط کشت ، بامواد عاری از میکروارگانیزم زنده و محسوس .

Sterilization: استریل کردن – روشی برای از بین بردن میکرو ارگانیسمها .

Sterilize: از بین بردن میکرو ارگانیزمها ، با استفاده از مواد شیمیایی ، حرارت ، نور و فیلتراسیون.

Sterile room: اتاق استریل – اتاق کار برای عملیات کشت بافت ، امروزه بجای اتاق استریل ، از اصطلاح محفظه تمیز ، استفاده می شود .

Steward bottle: فلاسک برای رشد سلولها و بافتها در محیط کشت مایع ، که در آن نمونه ها می توانند به صورت دوره ای در محیط کشت غوطه ور شوند .این فلاسک توسط استوارد ، طراحی شده است .

Sub culture : واکشت – انتقال یک سلول ، بافت یا اندام و غیره ، از یک محیط کشت به محیط کشت دیگر به منظور تولید توده سلولی مشابه.

Sub culture number: تعداد دفعاتی که سلولها واکشت می شوند . مثلا از یک ظرف به ظرف دیگر منتقل شده اند .

Suspension culture: کشت سوسپانسیون – نوعی کشت که در آن ، سلولهای ( مستقر ) و یا مجموعه ای از سلولها در حالی که در محیط کشت مایع شناورند ، رشد و تکثیر پیدا می کنند .

Symbiosis: همزیستی – دو ارگانیزم متفاوت که به منظور سود دو جانبه با هم زندگی می کنند .

Test tube: لوله آزمایش – لوله ای که در آن ف سلولها ، بافتها و غیره کشت می شوند .

Thermolabile: حساس به حرارت ؛ مثلا ماده ای که به دلیل حرارت از بین می رود .

Tissue culture: کشت بافت – کشت پروتوپلاست ، سلول بافت ، اندام ، جنین و بذر ، در محیط این ویترو .

Totipotency : توتیپونسی – پتانسیل سلول یا بافت ، برای تشکیل انواع سلولها و یا باز زایی گیاه کامل .

Transformation in-vitro : تولید برای مقاصد مختلف ، در اثر تغییرات وراثتی ؛ از طریق رشد پروپلاستها ، سلولها ، بافتها و غیره .

Virus – free: عاری از ویروس – گیاه ، سلول ، بافت ، یا مریستمی که هیچ گونه علائم ویروسی ندارد ، یا حاوی اجزای ویروسی قابل تشخیص نیست .

Vitamines: ویتامینها ، گروهی از ترکیبات آلی که بعضی موارد به کشت اضافه می شود ( ویتامین B_{1 ،} ویتامین C و غیره )

Vitrification: بیماری فیزیولوژی ، توضیح بیشتر در بخشهای 2 و 4 و 6 .

Vitro: در شیشه ، در یک لوله آزمایش ، بطری و غیره .

Vivo : بطور طبیعی ، کشت در داخل گلخانه ، مزعه ، و غیره .

X or x: در فصل 23 در مورد هاپلوییدها ، غالبا استفاده شده است ، به حداقل تعداد ( هم یه شکل ساختمانی ، و هم درمحتویات ژنی ) کروموزومهای متفاوت که می توانند با هم به شکل واحد فعالیت کنند ، اطلاق می گردد ( هرمز 1977)

Yeast extract: مخلوط مواد حاصل از مخمر .

فصل سوم :

1-3 مقدمه

تاریخچه کشت این ویترو ، در شکل 1-3 نشانداده شده است . در سال 1838 شوان و شیلدن تئوری توتیپوتنس را ارائه نمودند ، بر اساس این تئوری ، هر سلول ، مستقل بوده و در اصل ، قادر به تولید یک گیاه کامل است . در واقع ، تئوری آنها پایه و اساس کشت بافت و سلول گیاهی بود . اولین تلاش به وسیله هابرلانت در سال 1902 انجام شد ولی او در روش کشت بافت، نا موفق بود . معذلک بین سالهای 1907 و 1909 هاریون ، باروز و کارل ، موفق به کشت این ویروی بافتهای حیوانی و انسانی شدند ، گرچه محققین ، تحقیقاتی را در ارتباط با کشت ا ین ویترو ، در مورد بذور گیاهچه های ارکیده ، جنین و اندامهای گیاهی ، انجام دادند ؛ ولی در سال 1939 نوبکرت ، گوستریت و وایت ، برای اولین بار موفق به تولید گیاه حاصل از کشت بافت شدند . بعد از جنگ جهانی دوم ، پیشرفت در این زمینه بسیار سریع بود ، و نتایج با ارزش و مهمی برای کشاورزی ، جنگلداری و باغبانی ، به همراه داشت ( پیکریک 1979 ، بوجوانی و همکاران 1986). به دليل تاخير در كشف هورمونهاي نباتي كشت بافت گياهي پس از كشت بافت حيواني و انساني شروع شد. اولين هورمون گياهي كشف شده اكسين بود كه كه كمك شايان توجهي به كشت بافت گياهان درون لوله ازمايش كرد. كشف كينتين ها در سال 1955 به اين موفقيت بيشتر كمك نمود.

 

 

فصل چهارم

انواع كشت بافت

هر گياه شامل اندام هاي متفاوتي است كه هر يك از اين اندامها از معدودي بافت تشكيل شدهاند. و بافت ها نيز به نوبه خود از سلول هاي اختصاصي به وجود  امده اند .اگر ديواره اين سلول هاتوسطانزيم هضم شوند  پرتو پلاست حاصل ميشود.از انجايي كه گياه از مواد ساختماني بسيار متفاوتي تشكيل شده است انواع مختلفي از كشت اين ويترو نيز وجود دارد.

1.كشت گياه كامل:يك بذر ممكن است در شرايط اين ويترو كشت شود و يك گياهچه و نهايته يك گياه كامل توليد كند.

 

 

2.كشت جنين:در اين نوع كشت جنين جدا شده پس از حذف پوسته بذر كشت ميشود.

3.كشت اندام گياهي:يك اندام جدا شده در شرايط اين ويترو رشد ميكند. در كشت اندام انواع مختلفي مثل كشت مريستم  كشت نوك ساقه كشت ريشه كشت پرچم و غيره قابل تشخيص هستند .غالبا قسمت جدا شده (بافت يا اندام)به عنوان قلمه شناخته شده و كشت قلمه ناميده ميشود.

4.كشت كالوس :اگر يك بافت تمايز يافته جدا شود و در شرايط اين ويترو  توليد يك توده سلولي تمايز نيافته بنام كالوس  نمايد اين پديده را كشت كالوس مي نامند.

5.كشت سلول:كشت سلول هاي منفرد  كه به كمك انزيم ها يا به روش هاي مكانيكي از يك بافت گياهي  كالوس يا سوسپانسيون سلولي به دست مي ايند كشت سلول ناميده ميشوند.

6.كشت پروتو پلاست :كشت پروتو پلاست هايي كه در اثر هضم انزيمي ديواره سلول به وجود امده اند كشت پرو تو پلاست مي نامند.

دي فو سارد 3 نوع كشت اين ويترو را در گياهان عالي معرفي نموده است:             37

1:سازمان نيافته:كشت گياه تقريبا كامل  و يا اندام ها  كشت سازمان نيافته ناميده ميشود  كه در ان ساختمان وي‍ژه  و منظم گياه يا اندام حفظ ميشود  وتقريبا شبيه به تكثير رويشي از طريق قلمه  تقسيم كردن ساقه رونده و جوانه جانبي يا ساقه ميباشد.اگر ساختمان اوليه گياه يا اندام حفظ شود نتايج حاصل با گياه مادري مشابه خواهندبود.

2. سازمان نيافته: اگر سلول ها و يا بافتها  از يك بخش منظم گياهي تمايز نيافته جدا و سپس كشت شوند رشد سازمان نيافته (به فرم كالوس) صورت خواهد گرفت. در اين جا ممكن است كالوس به صورت دسته جاتي  از سلولها و يا سلول هاي منفرد باشد(كشت سوسپانسيون)

رشد سازمان نيافته اساسا" بر اثر كاربرد غلظتهاي بالاي اكسين و يا سيتو كينين در محيط رشد  به وجود ميايد .در كشتهاي سازمان نيافته ثبات ژنتيكي غالبا پايين است.

3.حد واسط:اين نوع كشت حد واسط نوع قبلي ميباشد.سلولهاي يك بافت يا اندام جدا شده ابتدا به صورت تمايز نيافته  در ميايند و سپس در اثر تقسيم بافت ويا لايه اي از بافت كالوس را تشكيل ميدهند كه از ان اندامهايي مثل ريشه و ساقه و يا حتي گياه كامل (جنين اوليه يا جنين) به سرعت به وجود خواهد امد .اين نكته را نيزبايد در نظر داشت كه ساختمانهاي منظم مي توانند از كشتهاي سازمان نيافته به وجود ايند.اين پديده با به كار گيري تكنيكهاي ويژه و يا به طور خود به خود انجام ميشود.در همه اين موارد نتاج حهصل كاملا شبيه به والدين خود نيستند.

 

 

فصل پنجم

 

 

تجهيزات ارمايشگاهي مور د استفاده در كشت بافت

 

1-5-لوازم و مواد مورد نياز

تجهيزات و وسايل لازم براي تاسيس يك از مايشگاه تخصصي كشت بافت به شرح زير ميباشد. براي كار كردن در مقياس كوچك وسايل ساده تري ميتوانند مورد استفاده قرار گيرند و موادي كه با ستاره مشخص شده اند مورد نياز نمي با شند .به عنوان مثال شستن ظروف را ميتوان به جاي استفاده از ماشين ظرف شويي با دست انجام داد و يا مخلوط كن فقط هنكامي مورد نياز است كه مقدار زيادي محيط كشت لازم باشد  . هم چنين در بر خي موارد ميتوان به جاي اب مقطر از اب يونيزه استفاده نمود و يا به جاي اتو كلاو از  ديگ زود پز معمولي استفاده  كرد . فقط   از مايشگاههاي بزرگ نياز به انبار جهت ظروف شيشهاي محيطهاي كشت و غيره دارند.

تهيه مجيط كشت:

-گاز –اب – برق و احتمالا" هواي فشرده و لوله هاي خلا

-ابگرمكن

انواع مختلف ظروف شيشه اي

-گرمكن با همزن مغنا طيسي

گرمكن يا چراغ مناسب براي لوله هاي بزرگتر. غالبا يك محيط كشت توسط بخار گرم مي شود.

- ديگ بخار براي گرم كردن محيط كشت

-ترازوي نيمه هساس براي توزين در حد گرم

-ترازوي حساس براي توزين در ميلي گرم

- قاشقك براي استفاده در هنگام وزن كردن

-مخلوط كن براي مقادير زياد محيط كشت

- اجاق مايكرو ويو براي  گرم كردن سريع محيط كشت و مخلوط اگار (بجاي گرمكن). از اين اجاق براي ذوب كردن  مواد منجمد نيز استفاده ميشود.

- فيلتر هاي ظريف (در حد ميلي متر )

-دستگاه تخليه اتوماتيك

  PH -  سنج

-دستگاه تقطير 

-دستگاه يون زدايي

- انواع مواد شيمييايي(غالبا گران قيمت)

- ساعت براي تنظيم زمان استريل كردن

-جا لوله اي براي قرار دادن لوله هاي ازمايش در داخل اتو كلاو

- ظروف فلزي جهت قرار دادن پتري ديش در داخل اتو كلاو

-لوله ازمايش  فلاسك و ظروف پلاستيكي

- وسايلي براي بستن درب لوله هاي ازمايش  و فلاسك ها (چوب پنبه ورق نازك  الومينيو مي پلاستيك يا در پوش فلزي و امثال)

-اتو كلاو يا ديگ زود پز

- محلي براي نگهداري مواد شيمييايي وظروف شيشه اي و غيره

- يك محل   استريل براي نگهداري محيط كشت و اب استريل و غيره

-مخزن ذخيره(تانك) اب مقطر و اب بدون ملح

-پي پت شور (ضد اسيد)

جدا سازي كشتها:

-          اتاقك تميز

-          منبع گاز در اتاقك تميز

-          استريو ميكروسكپ

-          چراغ بنسن براي توليد شعله(يا چراغ الكلي )

-          دستگاه ضد عفوني خشك براي چاقو وچاقوي جراحي و گيره( به جاي چراغ بنسن)

-          قيلتر كاغذي ( در صورت امكان صفحات شيشه اي) براي استفادهدر هنگام تهيه قلمه استريل.

-          پتري ديش براي وا كشت

-سا نتري فوژ( با دور كم)

-  هيپو كلريت براي ضد عفوني مواد گياهي

- الكل 96 در صد

- مخزن نسوز براي الكل

- ورقه هاي نازك يا مواد مشابه براي پوشاندن جعبه ها و غيره

تجهيزات كلي

-          اون جهت خشك كردن ظروف شيشه اي و غيره پس از استريل كردن

-          ظرف شويي اتو ماتيك

-          وسايل تنظيف(برس و غيره)

-          معرفهاي شيمييايي

-          چرخ دستي

-          يخچال براي نگه داري مواد شيمييايي و محيط كشت

-          فريزر كوچك

-          وان ضد اسيد حاوي اسيد كروميك و اسيد سولفوريك براي شستشوي كامل ظروف شيشه اي الوده.

 

 

۵-۵-شستشوي ظروف شيشه اي

ظروف شيشه اي پس از استفاده بايد بلا فاصله در آب گرم قرار گيرند ، به خصوص هنگامي كه حاوي محيط كشت جامد بوده اند . چون اگر آگار به جدار فلاسك و ظروف آزمايشگاهي بچسبند ، جدا كردن آن بسيار مشكل خواهد بود .شستشو بايد حتي الامكان سريعتر انجام شود تا از چسبيدن محيط كشت به جدار ظرف ها جلوگيري شود . پس از شستشو (ترجيحا با آب گرم و صابون) ظروف شيشه اي بايد با استفاده از يك برس ، تميز شوند . براي شستشو ، ابتدا از آب لوله كشي شهري و سپس از آب بدون ملح يا آب مقطر استفاده مي شود و نهايتا بايد تميز بودن ظروف به دقت كنترل شود . ظروف شيشه اي ، بايد بلا فاصله خشك شوند تا احتمال آلوده شدن آنها كاهش يابد چون ميكرو ارگانيزم ها براي رشد و توليد مثل به آب نياز دارند .

لوله هاي ازمايش به طريق زير تميز مي شوند:

ابتدا درب لوله ها برداشته شده و آگار و مواد گياهي ، با يك انبر بلند بيرون آورده مي شوند سپس زير جريان اب داغ به كمك برس ديواره اي لوله ي  آزمايش از داخل و خارج تميز مي شوند . بديهي است استفاده از ماشين ظرف شويي بسيار اسان تر است شستشوي نهايي ، با آب بدون ملح انجام مي شود . بهتر است ظروف شيشه اي قبل از اينكه مجددا مورد استفاده قرار گيرند ، استريل شده و به سرعت خشك و در يك محفظه ي استريل نگهداري شوند ( داخل يك قفسه ي عاري از گرد و غبار و به صورت سر وته )

۶-۵- روباتها(ادمهاي مصنوعي)در ازمايشگاههاي كشت بافت

دي براي(1986)اخيرا در يك مقاله ي تحليلي به سؤال زير پاسخ داده است:چرا در كشت بافت از روبات استفاده نمي شود.وي روباتها را به طور كلي شرح داده است(تاريخچه،توسعه وطبقه بندي)ساختمان كلي رباتهاوسيستمهاي بهره برداري ،انواع اجزاي حساس ،بينايي روباتهاوهمچنين كامپيوتر وهوش مصنوعي،در اين مقاله بررسي شده اند.دي براي همچنين موارد كاربرد (استفاده در كشاورزي،اتوماسيون ازمايشگاهها و استفاده در كشت سلولي وبافت)،اثرات بالقوه ي رباتها (مقايسه ي هزينه،طرز تلقي محققين در استفاده از انها) وبرتريهاي ديگر رباتها را شرح داده است. اين مقاله در برگيرنده ي اطلاعات ارزشمندي درباره ي امكانات بالقوه ي رباتها در حذف كارهاي پردرد سردر ازمايشگاههاي كشت بافت ،مخصوصا درتكثير گياهان،ودر كاهش هزينه هاي كارگري مي باشد.يك سيستم هوشمند روبات براي توليد گياهچه در روش اين ويترو،توسط دلبلانك همكاران شرح داده شده است دراين سيستم،گياهچه ها توسط روبات ،در محيط كشت گذاشته شده،از انجا برداشته وبه داخل ظروف مربوط (گلدان)منتقل مي شوند.

 

فصل ششم

تركيب و اماده سازي محيط كشت بافت

 

رشد و نمو اندامهاي جدا شده از گياه مادري در شرايط محيط درون شيشه تحن تاثير عوامل بسيار زياد و پيچيده اي قرار دارد كه بعضي از اهم انها عبارتند از:

1-     ساختار ژنتيكي گياه

2-     عناصر غذايي كم و پر مصرف، اب و قندها

3-     عوامل فيزيكي محيط رشد مانند نور، حرارت، اسيديته محيط كشت و غلظت گازهايي مانند اكسيژن و دياكسيد كربن.

4-     مواد الي مانند تنظيم كننده هاي رشد گياهي، ويتامين ها، پروتئين ها و ساير مواد.

 

خصوصيات ژنتيكي گياه يكي از عوامل بسيار مهم در موفقيت تكثير ان در محيط كشت بافت ميباشد.   اما حتي اگر گياه از لحاظ خصوصيات ژنتيكي امادگي رشد و نمو در محيط كشت بافت را داشته باشد بدون حضور مواد معدني و الي قادر نمي باشد كه در محيط اين ويترو رشد نمايد. بطور كلي عقيده براين است كه تمام گياهان و يا سلولهاي گياهان مختلف توتيپوتنت هستند و فقط شرايط محيط رشد انها در درون لوله ازمايش ميبايستي فراهم گردد تا انرا از خود بروز دهند.

قندها نیز باید به محیط کشت اضافه شوند، زیرا در این شرایط ،گیاه یا (قطعه گیاه)به طور کامل ، اتوتروف ((Autotroph يعني خودساز نیست.          

اهمیت عوامل فیزیکی رشد و نمو در شرایط این ویوو،به طور کامل برای حالت این ویترو نیز صادق است و به همان صورت ،اعمال میشود.این عوامل در فرایندهایی از قبیل جذب آب ،تبخیر،فتوسنتز،تنفس،رشد،گلدهی، ً

تشکیل میوه و غیره موثرند.

چهارمین فاکتور مهم ،گروهی از مواد آلی هستند که تنظیم کننده های رشد، به این گروه تعلق دارند.تنظیم کننده های رشد که در غلظت بسیار کم مورد احتیاج هستند،توزیع انواع مواد در داخل گیاه ،و بنابراین مسئولیت تقسیم سلولی ،رشد سلول  و غیره را بر عهده دارند.تنظیم کننده های رشد خصوصآ  اکسین و سیتو کینین،باعث نمو اندامها(تجدید حیات) در قسمت هایی از گیاه (قلمه یا ریز نمونه)که در محیط این ویترو،رشد یافته است،میشوند.همچنین این مواد در تولید جنین  در کشت سوسپانسیون سلولی حائز اهمیت فراوانند.                 58

بنابر این بسیار واضح است که تنظیم رشد و نمو یک گیاه فرایند پیجیده ای است که به ساختار ژنتیکی گیاه و همچنین به  محیط اطراف آن بستگی دارد. در زمان آماده نمودن محیط کشت ،بایستی اثرات متقابل این عوامل روی یکدیگر مد نظر قرار داده شود.

1-اثر متقابل مواد تنظیم کننده ی رشد با درجه حرارت :تغییرات در شکل گیری اندام ها ،میتواند بستگی به موجودیت (درون زا یا برون زا) اکسین یا سیتوکینین داشته باشد.بعضی اوقات ،غلظت اکسین یا سیتوکینین درون زا،شدیدًا تحت تاثیر درجه حرارت قرار می گیرد.

2-اثر متقابل نور و تاریکی ،با اکسین:IAA(ایندول استیک اسید)در نور،بیش از تاریکی تجزیه میشود.

3-اثر متقابل ژنوتیپ با مواد تنظیم کننده رشد:برخی ژنوتیپها برای رشد و نمو به غلظت زیاد ،و برخی به غلظت کم مواد تنظیم کننده ی رشد نیازمندند.توانایی بالقوه ی بیوسنتزیک هورمون خاص ،غالبا ً به صورت ژنتیکی  کنترل می شود.

4-اثر متقابل قند با نور:بعضی اوقات قند و نور می توانند موقتاً جایگزین یکدیگر شوند.جای گزینی ،به ظرفیت فتوسنتزی  در شرایط این ویترو نیز بستگی دارد.

قلمه ای که برای رشد و نمو در محیط این ویترو،قرار داده می شود، به موادّ متعددّی نیاز دارد، که این مواد در شکل 1-6 به صورت شماتیک، نشان داده شده است. این مواد، در حالت نمو در محیط این ویوو نیز مورد نیاز  می باشند (مثلاً آب،عناصر غذایی پرمصرف و کم مصرف). موٌادآلی و مخلوطهای غیر مشخٌصی که گیاه در حالت این ویترو نیاز دارد، الزلماً در رشد طبیعی، نیاز ندارد. به عبارت دیگر، گیاه در حالت این ویترو، هتروتروفیک (غیر خودساز) می باشد. در هر حال، مسلٌم است که آب، عناصر غذایی پر مصرف و کم مصرف، قند به عنوان یک منبع کربنه، و غالباً دو گروه از تنظیم کنندههای رشد(اکسین و سیتوکنین) در شرایط این ویترو، مورد لزوم هستند. چنانچه هر کدام از این ترکیبات موجود نباشد، معمولاً رشدو نموّی صورت نخواهد گرفت، و اندام یا بافت کشت شده در محیط این ویترو، از بین خواهد رفت. گاهی اوقات، اندام کشت شده، قادر است نیازهای خود را سنتز، و تامین کند. به طور مثال، اگر گیاهی در حالت این ویترو،احتیاجی به اکسین نداشته باشد، به آن گیاه، خود کفا ازنظر اکسین می گویند، که اکسین ساز نیز نامیده می شود. همان طوری که در شکل 6-1 نشان داده شده است، بعضی اوقات مخلوطهای غنی مشخٌصی برای القای رشد، اضافه می شود: معمولاً افزودن این مواد به محیط کشت، زمانی صورت می گیرد که محقٌق، از احتیاجات غذایی و هورمونی آن گیاه، آگاه نیست. امروزه،محیطهای کشت، اکثراً از مخلوطی از موادٌ مصنوعی به دست می آیند.مسّلم است که پیدا کردن یک محیط کشت متوازن که برای رشد بافتهای حاصل از تیپ خاّص گیاه(که در برسی منابع علمی هنوز گزارش نشده است)مناسب باشد،به وقت زیادی نیازمند می باشد. اگربه مخلوطی در حدود20 ترکیب مختلف مورد نیاز باشد، اغلب برای پیدا کردن نسبتهای صحیح از هر کدام به موارد خطا و اشتباه بر می خوریم.      

البته مقالات متعدّدی(گاترت1959، گامبورگ1976 ) درباره ی ترکیب عمومی محیط کشت وجود دارند،که اغلب کمکهای موثری می باشند.

اگر مادّه ژلاتینه، مثل آگار،به محیط کشت اضافه نشود،به آن، محیط کشت مایع،اطلاق می شود. کاربرد آگار،در بخشهای 6،4،2 آمده است.

برای افراد کم تجربه،انتخاب محیط کشت، مشکل است.بطوری که اغلب در مورد گیاهانی که د منابع علمی محیط کشت خاصّی برای آنها گزارش نشده، این سوال مطرح است که از کدام محیط کشت استفاده شود، در این مورد،

دی فوسارد(1976) پیشنهاد کرده است که آزمایش،با طیف گسترده انجام شود. وی، در این مورد،نتیجه گیری می کند که در یک محیط کشت، غالباً چهار گروه از مواد،جنبه ی حیاتی دارند:

از انجا که نیازهای گیاه مورد آزمایش، قبلاً مشخص نشده است،این چهار گروه از ترکیبات، در3غلظت( کم- متوسط- زیاد)پیشنهاد شده است:

1. قند(سازکارز): 1 ،2تا 4 در صد.
2. نمکهای پر مصرف(طبق گزارش موارشی و اسکوگ 1962) ¼تا ½میزان (غلظت کامل).                             
3. اکسین(مثلاً IBA ):01/5،0/0 تا5 میلی گرم در لیتر
4. سیتوکینین(مثلاًBA ): 01/5،0/0 تا 5 میلی گرم در لیتر

با توجّه به داشتن 3 غلظت متفاوت از هر کدام از 4ترکیب،نهایّه81=32گرم در لیتر،انجام ترکیب خواهیم داشت، که پس از آزمایش،از بین آنها،نوع اپتیمم برای رشد، انتخاب می شود.البته  درمرحله ی بعد، لازم است آزمایش های دقیق تری انجام دهیم: به عنوان مثال،اگر از آزمایشات سری اول، غلظت5/0 میلی گرم در لیتر اکسین غلظت اپتیمم بود، دراین مرحله، آزمایش را با مقادیر مختلف اکسین، بطور مثال: 05/0،1/3 , 0/0،5 /8،0/ 1،0و 5/1 میلی می دهیم.

روش دیگرآزمایش متنوع وسیعی از محیط های کشت است  که  به آن تکنیکMDA گویند. این تکنیک ،خصوصاً برای کشت پروتوپلاست

گونه های توتون Nicotiana)) و اطلسی( petunia )وبرای پروتوپلاست

 مزوفیل غلات ،کاربرد دارد.در این تکنیک از قطرات 40میکرومتری ،به عنوان واحد آزمایشی استفاده میشود.

ترکیب محیط های کشت مختلفی که غالبا در کشت سلول و بافت گیاهان و همچنين در طي اندام زايي و جنين زايي رويشي مورد استفاده قرار می گیرند ( مقادیر داده شده برای یک لیتر محیط کشت که با اب مقطر به حجم می رسد می باشند) بصورت زير تهيه ميگردند.

9-1- محيط­هاي پودري [1]

محيط هاي پودري شديداً جاذب الرطوبه مي باشند و ميبايست از تماس با رطوبت هوا محافظت شوند. پس از بازكردن درب بطريهاي شيشه اي حاوي محيط پودري، بايستي مطمئن شد كه درب آن مجدد كاملاً بسته شود. محيط هاي  خشك را ميبايستي در 8-2 درجه سانتيگراد و كاملاً بسته نگهداري نمود.

تهيه محيط كشت گياهي:

1. تقريبا 90% حجم نهايي مورد نياز آب مقطر يون­زدايي شده را اندازه­گيري نموده و می­بایست ظرفي دوبرابر اندازه حجم نهايي بكار برده شود.
2. در حال به­هم خوردن آب محيط پودري اضافه شده و تا حل شدن كامل، آنرا باید به­هم زد. برخي محيط­هاي پودري كندتر از ديگر محيط­ها حل خواهند شد. به­عنوان مثال، محيط پودري حاوي سولفات منيزيم (MgSo₄) كندتر از محيط حاوي سولفات منيزيم آبدار (MgSo₄.7H₂O) حل خواهد شد. اين يك پديده فيزيكي مي­باشد و حرارت دادن محلول ممكن است به­منظور حل نمودن پودر، مورد نياز باشد.
3.  ظرف شيشه­اي اوليه با آب مقطر يا آب يون­زدايي شده شستشو داده تا اثرات پودر ازبين برود و آب آن­را می­بایست به محلول محيط كشت اضافه نمود.
4.  در این مرحله مكمل­هاي دلخواه پايدار به گرما به محلول محيط اضافه می­شوند.
5.  جهت حصول به حجم نهايي، آب مقطر يون­زدايي شده اضافي به محلول محيط كشت اضافه می­شود.
6.  جهت ثابت نگهداشتن PH، از هيدروكسيد سديم، هيدروكسيد پتاسيم يا اسيد هيدروكلريك استفاده می­شود.
7.  بالاخره محيط كشت را در ظروف كشت توزيع کرده و پس از اتوكلاو­كردن، مكمل­هاي حساس به گرما اضافه می­گردند.
8. محيط در اتوكلاو قابل اطمينان با فشار 15 اتمسفر و دماي 121 درجه سانتي­گراد به مدت زمان مناسب استريل شود. دماي بالاتر ممكن است سبب ضعف در رشد سلول شود.
   

 

مخلوط­هاي ويتاميني پودري شديداً جاذب الرطوبه مي­باشند و مي­بايست از رطوبت هوا محافظت شوند. پس از بازكردن درب بطري­هاي شيشه­اي حاوي مخلوط ويتاميني، باید مطمئن شد كه كاملاً بسته شده­اند. مخلوط ويتاميني پودري در 8-2 درجه سانتيگراد نگهداری شده و از بسته بودن درب آن باید اطمینان کامل داشت.

 

9-2- تهيه محلول­هاي پايه ويتامين[2]

1. تقريبا 90% حجم نهايي مورد نياز آب مقطر يون­زدايي شده را اندازه­گيري نموده و در ظرفي كه می­بایستي دوبرابر اندازه حجم نهايي محلول است ريخته شود.
2.  در حال به­هم خوردن آب محيط پودري اضافه شده و تا حل شدن كامل، آنرا باید به­هم زد. ممكن است نياز به افزايش دما يا  pHباشد (32-35 درجه سانتي­گراد).
3.  ظرف شيشه­اي اوليه با آب مقطر يا آب يون­زدايي شده شستشو داده تا اثرات پودر ازبين برود و آب آن­را می­بایست به محلول محيط كشت اضافه نمود.
4. جهت حصول به حجم نهايي، آب مقطر يون­زدايي شده اضافي به محلول محيط كشت اضافه می­شود.
5.  محلول پايه x1000 تهيه شده ميبايست با غلظت 1ميلي­ليتر بر ليتر محيط كشت اضافه شود تا غلظت نهايي مناسب ويتامين­ها در محيط كشت، حاصل شود.

محلول پايه x100 تهيه شده ميبايست با غلظت 10 ميلي­ليتر بر ليتر محيط كشت اضافه شود تا غلظت نهايي مناسب ويتامين­ها در محيط كشت حاصل شود.

 

2-6 ظروف شیشه ای و پلاستیکی

اساساً کشت این ویترو را میتوان در ظروف شیشه هی و یا پلاستیکی در

 اندازه ها و شکل های مختلف انجام داد.شیشه این مزیت را دارد که دارای دوام بیشتری است و میتواند اتوکلاو شود.پلاستیک به طور طبیعی عمر کوتاهی دارد(پلاستیک ارزان قیمت و معمولاً یکبارمصرف است)و همیشه برای مصرف در اتوکلاو مناسب نیست.دوام پلاستیک بستگی به مقاومت آن در برابر حرارت و نوع مواد شیمیایی تمیز کننده دارد.پلاستیک این عیب را دارد که اتیلن متصاعد میکند و تجمع اتیلن در ظرف برای نمونه ها زیان بار است.

نمودار6-1:مجموعه موادی که اغلب برای القای رشد و نمو به محیط کشت اضافه می شود.این مجموعه از آب ترکیبات آلی (سمت چپ)،ترکیبات غیر آلی (سمت راست)و گروهی از مخلوط مواد غیر مشخص (قسمت پایین)تشکیل می گردد.                                                                                                                                                                                                                                          

 

 

 

نیازهای غذایی و هورمونی کشت بافت و اندامهای گیاهی
آب
PH	عناصر    پرمصرف        کم مصرف	موادالی
	CO             Fe         N        NI              Zn                P AL              B                K MO            Mn             Ca I                 Cu             Mg S	قند اسیدهای آمینه ویتامین ها اکسین سیتوکینین                تنظیم کننده های رشد جیبرلین اسیدآبسیسیکﻰ اتیلن
	عصاره ی مخمّر شیر نارگیل عصاره ی گیاهی                                  مخلّوطی از موّاد غیر مشخّص  کازیین هیدرولیز شده پیتون و تریپتون

 

انواع مختلفی از شیشه ها وجود دارند که مصرف آنها میتواند با عواقب فیزیولیژیکی همراه باشد.در تحقیقات استفاده از پیرکس یا شیشه های مشابه(سیلیکات بر)توصیه میشود.شیشه های ارزان قیمت با کیفیت پایین میتواند کاتیون های سمی نظیر سدیم سرب و ارسنیک را در محیط آزاد کند.پیرکس ترجیحاً برای کار با پروتوپلاستها و کشت تک سلول و کشت مریستم توصیه شده است.در باغبانی عملی استفاده از ظروف شیشهای پیرکس گران قیمت ضرورتی ندارد.و اغلب میتوان از ظروف شیشه ای ارزان قیمت بدون هیچ گونه ضرری استفاده کرد.این موضوع از نظر اقتصادی حایز اهمیت است .از آنجا که ظروف پلاستیکی غالباً محکم بسته میشوند،باید توجه شود که باعث تجمع اضافی اتیلن یا CO2 نشود.

ظروف شیشه هی ذیل برای کشت بافت به کار میروند.

1-لوله های آزمایش (بعضی اوقات با سر پیچ)                   

2-پتری دیش

3-ارلن مایر(برای هر دو نوع محیط کشت مایع و جامد)

4-ظروف مشهور به استوارد( بطری های استوارد).steward flask

5-در باغبانی عملی حتی می توان از شیشه های شیر،آبمیوه و مواد غذایی استفاده کرد.

در آزمایشگاه های تجاری کشت بافت،خصوصاً برای ازدیاد گیاهان از انواع لوله ها (به خصوص پلاستیکی )،جعبه ها و غیره، استفاده میشود.چنانچه پلاستیک برای اتوکلاو کردن مناسب نباشد ،آن را در کیسه های پلاستیکی (بدون محیط کشت)قرار داده،سرشان را بسته و توسط اشعه گاما استریل مینمایند.انتقال محیط کشت استریل به این ظروف ،در داخل محفظه با جریان هوای استریل انجام میشود.

شکل و اندازه ی شیشه(یا پلاستیک) میتواند پیامد های مهمی داشته باشد.به عنوان مثال میتوان یک لوله آزمایش را با یک پتریدیش مقایسه نمود.لوله آزمایش دارای حجم نسبتاً زیاد وسطح تماس خیلی کم، است.و در نتیجه میزان تهویه و خشک شدن کاهش می یابد.به طوری که شانس محدودی برای آلودگی وجود دارد.از طرف دیگرپتریدیش دارای حجم کمتر و سطح تماس بیشتری است.تهویه آن مناسب،خشکیدن آن سریع تر،ولی امکان آلودگی آن خیلی زیاد است.بنا براین بستن درپتریدیش اهمیت بیشتری از لوله آزمایش دارد(با پارافیلم و غیره).

به طور کلی واقعیت این است که کشتهای در ظروف بزرگتر ،رشد و نمو (تکثیر)بهتری نسبت به ظروف کوچکتر دارند.احتمالاً این موضوع به دلایل زیر است:     

1-حجم بزرگتر می باشد،و در نتیجه ،دقت لازم از نظر گازهای متصاعد شده ی سمی(اتیلن،  CO2 و غیره)بیشتر است.

2-میزان بیشتری از مواد غذایی در واحد سطح ،در اختیار می باشد.پیریک و بوتر(داده های منتشر نشده)اخیراًدریافته اند که گیاهچه های گیاه (phalaenopsis) در ظروف شیشه ای،بهتر از لوله ای آزمایش،رشد میکنند.

 

3-6 آماده سازی محيط كشت                

تعداد زیادی مواد و حتی در بعضی موارد،مخلوطی از مواد به محیط کشت اضافه میشوند.جهت احتراز از آلودگی ،لازم است که برای هر ماده از قاشق جدا گانه ای استفاده شود.همچنین ترکیبات مصرف نشده را هرکز نباید به شیشه های اصلی بازگردانید.غلظت یک ماده ی به خصوص را می توان بر حسب واحد های گوناگون بیان کرد.در زیر به اصطلاحات کلی اشاره میشود:

 

-درصد حجمی: برای شیر،نارگیل و غیره به کار میرود:5درصد آب نارگیل یعنی 5میلی لیتراز آن که به 950 میلی لیتر آب اضافه شود.

-درصد وزنی:برای آگار و قندها به کار میرود.2درصد یعنی 20گرم ماده  در هر1000گرم (یک لیتر)از محلول غذایی.

-مولار:01/0یعنی 100/1مول در لیتر (یک مولار)همان وزن مولکولی بر حسب گرم است.از این واحد غالباً غالباً برای تنظیم کننده های رشد استفاده میشود.

میلی گرم در لیتر:  ^{7 –} 10به معنای 1/0میلی گرم در لیتر ،  ^6-10   یعنی یک میلی گرم در لیتر.  ازاین واحد نیز به میزان زیادی برای تنظیم کننده های رشد استفاده می شود.

-میکروگرم در لیتر:یعنی 001/0میلی گرم در لیتر.

-ppm یا قسمت در میلیون:یک ppmیعنی یک میلی گرم در لیتر.

       در ارتباط با این واحدها ،غلظت یک ماده ی خاص در محیط را میتوان اندازه گیری  نمود.این کار اساساً از دو راه میتواند صورت گیرد:

1-واحدهای وزنی:مثلاً میلی گرم در لیتر،یا گرم در لیتر.در منابع علمی ،غلظت یک گرم در لیتر ممکن است به صورت ^3-10
؛و غلظت یک یک میلی گرم در لیتر  به صورت ^6- 10 ارائه گردد.ممکن است به شکل ppmگفته شود:یک ppmیعنی^-6 10  یا یک میلیگرم در لیتر.متخصصین فیزیولوژی گیاهی استفاده از واحد های وزنی را غیر قابل قبول می دانند،زیرا مقایسه فعالیت های فیزیولوژیکی 1میلی گرم در لیتر از IAAو 1میلی گرم در لیتر از IBAصحیح نیست. مقایسه ی صحیح ،عبارت خواهد بود از یک میکرو مول از IAAبا یک میکرو مول از IBA،چرا که 1میکرومول از IAA حاوی همان تعداد مولکول هایی است که یک میکرومول IBA دارا می باشد.اما در مورد یک میلی گرم از IAA،و یک میلی گرم در لیتر از IBA،چنین چیزی صادق نیست .از آنجا که وزن مولکولی IAAوIBAتفاوت دارند ،در بسیاری از مواد ،خصوصاًغلظت مولار 0 تنظیم کننده های رشد اساساً باید غلظت به صورت مولار داده شود.

2-غلظت مولار (M)،میلی مولار(mM) یا میکرو مولار(μM)یک محلول مولار (M) همان مقدار از ماده (بر حسب گرم)به اندازه ی وزن مولکولی

خود دارد؛یک میلی مولار^-3 10 مولار و یک میکرو مولار 10^-6مولار یا

^-3 10میلی مولار است.از آنجا که غلظت به صورت مولار در کشت بافت گیاهی بیشتر مورد مصرف داردمیلی مولار است.از آنجا که غلظت به صورت مولار در کشت بافت گیاهی بیشتر مورد مصرف داردمیلی مولار است.از آنجا که غلظت به صورت مولار در کشت بافت گیاهی بیشتر مورد مصرف دارد؛چند مثال در زیر ذکر می شود:

1-وزن مولکولیIAA=175.18

2-محلول یک مولار IAAدارای 175.18گرم در لیتر است.

3-محلول یک میلی مولار IAAدارای 0.17518گرم در لیتر یا 175.18میلی گرم در لیتر می باشد.

4-یک میکرومولار IAAدارای 0.00017518گرم در لیتر یا 0.17518میلی گرم در لیتر است.

5- وزن ملكولي كينتين ريبوزيد 3/347 است.

تبدیل از میلی گرم در لیتر به (میلی)مولار  و برعکس را می توان به صورتی که در زیر برایCaCl₂.2H₂o انجام شده است محاسبه نمود. وزن مولکولی CaCl₂.2H₂O برابر است با:      

40.08+2×35.453+4×1.008+2×16=147.018

(وزن های اتمی CaوClو Hو Oبه ترتیب 40.08 و 35.453 و 1.008 و 16 است.)

عدد میلی مول CaCl₂ .2H₂Oدر لیتر ،می تواند از تقسیم میلی گرم      CaCl_{2 .}2H₂O_­­­­­ در لیتر ،به وزن مولکولی CaCl_{2 .}2H₂O به دست آید.مثلاً                    

440 میلی گرم در لیتر از    CaCl_{2 .}2H₂O  برابر است با :                                          Mm CaCl_{2 .}2H₂O  2.99      =147.918÷440

 و بر عکس 2.99 میلی مولار ازی CaCl_{2 .}2H₂O برابر است با :

میلی گرم در لیتر          2H₂O CaCl_{2 .}  2.99×147.018=440mg/li

از محاسبات بالا مشخص می شود که با کاربرد غلظت مولار یا میلی مولار ،لزومی به دانستن تعداد مولکول های آب کریستالیزه نیست.برای مقایسه ی صحیح دو محیط کشت مختلف ،لازم است تعداد میلی گرم در لیتر ،به صورت میلی مولار محاسبه شود. این مورد در زیر نشان داده می شود:

 

محیط کشت Yبا ترکیبات:                                                                محیط کشت X با ترکیبات :

500 میلی گرم در لیتر NH­4NO3                                                            1650  میلی گرم در لیتر NH­4NO3 500 میلی گرم در لیتر KNO3                                                                    1900 میلی گرم در لیتر KNO3 347 میلی گرم در لیتر Ca(NO3)2                                                           440 میلی گرم در لیتر CaCl2.2H2o                                   چنانچه آنرا به صورت میلی مول محاسبه کنیم، به صورت در لیتر در خواهد آمد: 25/6 میلی مول NH­4NO3                                                            6/20  میلی مول NH­4NO3 95/4 میلی مول KNO3                                                                    8/18 میلی مول KNO3 11/2 میلی مول Ca(NO3)2                                                           99/2 میلی  مول CaCl2.2H2o                                 محاسبه برای یونهای گوناگون: 25/6 میلی مول NH4+                                             6/20 میلی مول NH4+ 42/15 میلی مول NO3-                                           4/39 میلی مول NO3- 95/4 میلی مول K+                                                  8/18 میلی مول K+ 11/2 میلی مول Ca2+                                              99/2 میلی مول Ca2+ 0 میلی مول Cl-                                                       98/5 میلی مول Cl- جمع: 67/21 میلی مول ازت                                                   60 میلی مول ازت

 

از محاسبات بالا ، می توان مشاهده کرد که تقریبا مقدار ازت (NO­­₃^-و NH₄⁺) در محیط کشت x سه برابر مقدار ازت در محیط کشت y است. محیط کشت، باید به صورت ذیل ، آماده شود: فلاسک حاوی آب مقطر، در دستگاه گرم کننده، قرار داده شود. اگر 600 میلی لیتر محیط کشت لازم باشد، حدود 550 میلی لیتر آب باید گرم شود. سپس قند به میزان وزن مورد لزوم به آن اضافه می شود. ( در این حالت باید ظزف را از محوطه گرم کننده خارج گردد) سپس نمک های پر مصرف و کم مصرف را اضافه کرده و بعد اکسیژن و یا سیتوکنین و سایر ترکیبات اضافه می شود. محلول بخوبی مخلوط می گردد تا وقتی که مواد حل شوند، در ادامه محلول را به جوش آورده و آگار به میزان لازم( با استفاده از یک قیف ) اضافه می گردد. در هر اضافه کردن بایستی دقت شود که از بهم چسبیدن مواد و تشکیل شدن گلوله و کف کردن ، احتراز گردد. آگار را می توان در یک بشر با آب سرد مخلوط و بعد اضافه نمود. آگار را نباید به آب در حالت جوشیدن اضافه کرد؛ زیرا این کار باعث پختن زیاد محیط کشت و بروز اثرات سوء خواهد شد. در پایان برای رسیدن به حجم 600 میلی لیتر آب اضافه خواهد گردید. PH با کاغذ های لیتموس یا PHسنج اندازه گیری و در صورت لزوم تنظیم می شود. پس از افزایش تمام مواد ، و رسیدن حجم به 600 میلی لیتر، PH باید 6 باشد. اکنون می توان لوله های آزمایش ، فلاسکها و غیره را با محیط کشت، پر کرد. لوله ای آزمایش و ظروف ارلن مایر، باید تا حدود دو سوم پر شود. فلاسک بوخنر برای جابجایی محیط کشت به لوله های آزمایش و جلوگیری از تماس با دیواره ها و قسمتهای خارجی لوله، مورد استفاده قراقر گیرد. نکات زیر برای آماده سازی محیط کشت اهمیت درند:

1-        برای آماده کردن محیط کشت، حتی المقدور از مواد شیمیایی استفاده شود. برداشتن مواد با قاشقک تمیز و وزن کردن آنها با ترازو حساس انجام شود.                     67

2-        گاهی اوقات به دلایل اقتصادی می توان از محیط کشت آماده استفاده کرد.

3-        آگار و قند، باید در حد مورد نیاز وزن شوند؛ اما هناصر پر مصرف و کم مصرف را می توان از محلول های ذخیره، به کار برد. اغلب محلولهای ذخیره تنظیم کننده های رشد و ویتامین ها، بطور تازه آماده می شوند.

4-        گاهی اوقات نگهداری محلولهای ذخیره در حرارت پایین سبب رسوب مواد می گردد که می توان مشکلزا باشد زیرا جوشاندن دوباره آن باعث تبخیر آب و در نتیجه تغییر غلظت می شود.

5-        اگر رشد زیادی در طول چند هفته صورت گرفت، ممکن است مواد غذایی تخلیه شده باشند که بایستی واکشت ( کشت مجدد) صورت گیرد.

6-         بخار دادن محیط کشت( بجای جوشاند) برای حل آگار ایمنتر بوده و تجزیه شیمیایی کمتری را سبب خواهد شد.

7-        موادی ( محلولهایی) که در اثر حرارت تغییر می کنند بعد از آن که محلول اصلی اتوکلاو شد و تا حرارت بین 45 تا 50 درجه سانتی گراد سرد و خنک گردید باید توسط اترلیزاسیون فیلتری به  آن اضافه شوند.

پاسخ به این سوال که کدام محیط کشت را به کار بریم مشکل است چراکه کاربرد محیط کشت به عوامل متعددی بستگی دارد:

 

1-        گیاه مورد آزمایش : به عنوان مثال، بعضی گونه ها به نمک حساس هستند؛ در حالی که گونه های دیگر می توانند غلظت بالای نمک را تحمل کنند. بعضی گونه ها به افزایش ویتامین B₁ واکنش نشان می دند نیازبه تنظیم کننده ها خصوصا اکسین ها و سیتوکنین ها نیز خیلی متغیر است و موارد دیگر...                     68

2-        سن گیاه : بافت های جوان می توانند بدون اکسین ریشه زایی کنند اما بافت های مسن به اکسین نیازمندند.

3-        سن اندام: اندامهای جوان( در حال تقسیم سریع سلولی) نسبت به سایر بافت ها داری نیازهای مختلف هورمونی هستند.

4-        نوع اندام مورد کشت: اگر ریشه ها کشت شوند، نیار به افزودن ویتامینB₁ می باشد

5-        در کشتسوسپانسیون( معلق) چنانچه کالوسها برای مدت زمان طولانی نگهداری شوند نیاز کمتری به تنظیم کننده های رشد دارند.

6-        در حالت این ویترو، نیاز های خاص خود را دارند. به عنوان مثال ریشه های نابجا غالبا فقط بعد از اضافه کردن اکسین ظاهر می شوند، در حالی که ساقه های نابجا می توانند بعد از افزایش سیتوکنین ظاهر شوند. زمانی که نیازهای غذایی یک گیاه نا معلوم است بشرط اینکه گیاه به غلظت بالای نمک حساس نباشد، می توان از مخلوط عناصر پر مصرف و کم مصرف موراشی و اسکوگ ( 1963) استفاده کرد.

اگر گیاه کمی به نمک حساس است می توان از مخلوط عناصر پر مصرف و کم مصرف هلر ( 1953) استفاده کرد. و چنانچه گونه به این نمک خیلی حساس باشد مخلوط عناصر پر مصرف ناب ( 1984) را میتوان انتخاب کرد. فرم معمول قند بین 3-2 % ساکاروز است. اگر یک محیط کشت جامد مورد نیاز باشد ، نهایت 7/0 % آگار از نوع دیفکوباکتر به عنوان ماده ژله اضافه می گردد. توصیه میزان اکسین و سیتوکنین خیلی مشکل است و جزئیات مربوط به آن ، در بخش 7-4-6 داده شده است. افزودن ویتامین ها و ترکیبات متفرقه به ترتیب در بخش های 8-4-6 و 9-4-6 آماده است.

 

4-6-ترکیب                                               

1-4-6- آب

   به کیفیت آب ، توجه زیادی باید معطوف شود، زیرا 95 درصد از محیط کشت را آب تشکیل می دهد. توصیه می شود، برای موارد تحقیقاتی ، آبی به کار برده شود که در ظروف شیشه ای پیرکس ، تقطیر شده باشد. و برای تحقیقات با پروتوپلاست، سلول و مریستم، از آبی که دوباره تقطیر گردیده است استفاده می شود. برای اطمینان کامل از آب مقطر با کیفیت خوب، دستگاه مولد آب مقطر باید بطور منظم به منظور جلوگیری از جرم ، تمیز شده و قبل از استفاده، با آب فاقد یون شسته شود. برای احتراز از ذرات بجا گذاشته شده آب یونیزه شده در دستگاه آب مقطر، باید یک صافی بین دستگاه سازنده آب یونیزه و دستگاه تقطیر جاسازی شود.

   در سالهای اخیر برای کشت بافت از آبی استفاده می شود که توسط اسمز برگشتی خالص سازی شده است. پس از این خالص سازی ، می تواند با سایر روشهای خالص سازی نظیر یونیزه کردن، تقطیر و فیلتراسیون ، همراه گردد. بهتر است برای نگهداری آب مقطر       

اگار ها

محيط هاي كشت مايع

شيشه اي شدن

از صفحه 69 تا 79 وجود ندارد

//////////////////////////////////////////////////

این حالت ، موارد زیر را سبب می شود:  

1-در نتیجه کاهش یافتن جذب آب ، ویتریفیکاسیون ، کمتر می شود.

2-از افزایش ساقه های جانبی جلوگیری می شود.

3-پتانسیل ماتریکس تغییر می کند ( جذب آب مشکلتر می شود)

4-سبب می شود که تماس قلمه با ماده غذایی کمتر شود( افزایش مشکل جذب آب)

5- در اختیاز بودن عناصر ماکرو و میکرو که به محیط کشت اضافه شده اند، بسته به غلظت آگار،تغییر می کند.

3-4-6-قند

قند جزء بسیار مهمی در هر نوع محیط کشت است، و چون معمولا شرایط رشد برای فتوسنتز کافی نیست، و یا اصولا به علت تاریکی ، فتوسنتز انجام نمی شود، اضافه ترکردن قند به محیط زیست ، ضروری است. بافتهای سبز در حالت این ویترو ، به قدر کافی اتو تروف (خودساز) نیستند. غلظت CO₂ درداخل لوله آزمایش نیز می تواند برای فتوسنتز محدود کننده باشد ( گیبسون 1997) در عمل ،‌اضافه کردن CO₂ خیلی مشکل و گران است . در واقع اهی تبادلات ضعیف گازی سبب میش ود که غلظت در لوله های آزمایش یا سایر ظروف CO₂ در لوله های آزمایش یا سایز ظروف خیلی بالا رفته و در نتیجه مسومیت ایجاد  کند. معمولا در کشت این ویترو ، از ساکارز با غلظت 1 تا 5 درصد استفاده می شود زیرا این قند نیز به وسیله گیاه سنتز شده و به صورت طبیعی در گیاه منتقل می شود. از گلوکز و فروکتوز نیز ممکن است استفاده شود. غلظت قندانتخاب شده بستگی زیادی به نوع و سن مواد در حال رشد دارد. به عنوان مثال جنینهای بسیارجوان ، به غلظت نسبتا بالایی از قند احتیاج دارند. معمولا با افزایش غلظت قند رشد و نمو زیاد می شود، تا وقتی که به یک حد اپتیمم برسد و سپس در غلظت ( خیلی) بالا کم می شود( شکل 5-6) رشد گیاه کامل مثل گیاهچه ای های ارکیده نیز به میزان زیاد تحت تاثیر غلظت قند قرار دارد( شکل 6-6) ساکارز یا قند معمولی که از بازار خریداری می شود معمولا کافی است زیرا قند خالص شده است و طبق آزمایشات کارخانه های سازنده دارای 94-99 درصد ساکارز، 02/0 درصد آب ، 04/0 درصد سایر مواد ( مواد آلی و همچنین رافینوز ، فروکتوز ، گلوکز) است. هیچ دلیلی وجود ندارد که نشان دهد سایر مواد آن ، بتوانند در محیط کشت این ویترو سمیت ایجاد کنند.

همان گونه که در قسمت 2-3-5 بیان شد قند می تواند در نتیجه اتوکلاو کردن، تغییراتی پیدا کند که PH یکی از عوامل مهم است ( بخش 5-4-6)باید این مسئله را نیز در نظر داشت که طی کاشت این ویترو ( مثلا باکشت ریشه) قندها می توانند در محیط کشت تغییر یابند. هیدرولیز ساکارز در نتیجه آنزیم اینورتاز ( از دیواره های سلولی) یا از طریق آنزیم های خارج سلولی[3] ( بورلترم 1957 و ستون و استریت 1968) صورت می گیرد . همچنین تغییر ترکیب قند محیط کشت در کشت کالوس هم می تواند اتفاق افتد ( جورج و شرینگتون 1984) در این جا به نظر می رسد که وجود یا عدم IAA در محیط کشت خیلی مهم است. سایر قندها نیز می توانند به وسیله بافتهای گیاهی ، هیدرولیز شوند.

 

مارتزکی و همکاران (1971) نشان داده اند که هیدرولیز نشاسته خارج سلولی درزمان رشد سوسپانسیون سلولی نیشکر امکان پذیر است.

مشکل است بتوان گفت اتوکلاو کردن قندها در کشت این ویترو قابل توصیه است یا خیردر منابع هم روی این مساله ابهاماتی وجود دارد، در بعضی موارد ، اتوکلاو کردن توصیه شده ( بال 1953) و در مواردی توصیه نشده است ( استهزل و کاپلین 1969). برای انجام موفق یک آزمایش و يا توليد و تكثير گياه از طريق کشت بافت و ايجاد اندامهاي نابجا در قطعات گياهي مورد كشت و يا وادار نمودن انها به جنین زایی رويشي، تركيب محیط کشت که نمونه ها در ان قرار ميگيرند، نقش اساسی و سرنوشت ساز دارد. اگر چه گیاهان الی كه واجد تمام اندامها بوده، اتوتروف ميباشند و ميتوانند در حضور نور، اتمسفر نرمال، اب و مواد غذایی کافی بخوبی رشد نمايند، ولی اندامها و بافت های جداشده از انها اين توانايي را از دست داده و پس از جداشدن از گياه مادري و كشت در لوله ازمايش هتروتروف ميگردند. لذا اين مواد گياهي نياز دارند كه مواد غذايي بطور كامل در اختيارشان قرار گيرد. در يك گياه كامل برای اينكه سلولهای ریشه رشد نمايند به مواد غذایی تهيه شده توسط شاخ و برگ نیاز دارند. علاوه بر مواد غذايي رشد اندامهاي گياه تحت تاثیر هورمون¬های که در اندامهای بخصوص ديگري از همان گياه سنتز می گردند و از طرق مختلف مثلا از طریق اوند ها و يا بافت هاي پارانشيمي به منطقه مورد نظر رسیده نيز کنترل ميگردد. در بذور گياهان نيز وضع به همين منوال بوده و جنين درون انها جهت جوانه زنی متكي به مواد غذايي و هورمون¬هايي هست كه در بخش هاي ديگر بذر ذخيره و يا سنتز ميگردند. بنا بر این چون یک بافت بخصوص در طی مراحل رشدی خود وابسته به واردات این مواد از نقاط دیگر گیاه می باشد، لذا از این لحاظ یعنی نیاز هورمونی و غذايي می تواند فقط در یک گیاه کامل اتوتروف محسوب گردد. در کشت بافت نيز سلولهای زنده یک قطعه جدا شده از یک گیاه كامل دراي موقعیتي شبیه به یک بافت مشخص درون گیاه کامل ميباشند ولي با اين تفاوت كه در مورد كشت بافت این محیط کشت می باشد که وظیفه رسانیده مواد غذایی را که در گیاهان کامل بعهده سایر بافت ها و اندام ها است، به عهده دارد (تصوير بعد). لذا در کل این گونه کشت ها هتروتروف ميباشند و در حالات استثنايي بعضي از انها در حضور نور و پس از تکامل کلروپلاست داراي یک سیستم فتومیکسوتروف ميگردند (Neumann, 1995). در این کشت ها انرژی مورد مصرف اندامها مورد كشت از طریق ارائه مواد غذایی مختلف مانند هیدروکربن هاي اضافه شده به محیط کشت تامين ميگردد كه در ادامه در باره هركدام از انها بحث ميشود.

الف- قندهاي محیط های کشت

هیدرو کربن ها موجود در محیط های کشت به فرم مونو و دی ساکارید می باشند ولي در اغلب موارد اين ساکاروز است كه در غلظت های متفاوت مورد استفاده قرار می گیرد و در اغلب ازمایشات نيز نتیجه رضایت بخشی را ارائه نموده است (Charriere and Hahne, 1998; LilienKipnis et al. 1994).

 

 

 البته ساكارز تنها منبع كربوهيدرات مورد مصرف در محيط كشت نبوده بلكه استحصال یک رشد خوب در اندامهاي گياهي موجود در کشت بافت می تواند توسط مونوساکارید ها و حتي تعداد زیادی از مواد تغییر شکل نیافته دیگر مانند اب پنیر که بعنوان منبع قندها محسوب می گردند نيز بدست اید. بطور مثال در بررسي ديكلارك و كوربان برروي اثر تنظيم كننده هاي رشد و نوع قند برروي تشكيل كالوس درخت هلو واريته البرتا در محيط جامد (MS) مشاهده گرديد كه نمونه هاي مورد كشت برگ اين گياه كه در محيط كشت حاوي گلوكوز قرار داشتند مقدار زياد تري كالوس سبز رنگ متراكم نسبت به انهايي كه در محيط كشت حاوي فروكتوز و يا ساكاروز قرار داشتند نمودند (Declerck and Korban, 1996):. و همچنين وقتي كه قطعات برگ گل سرخ از محيط كشت حاوي 100 mu M) 2,4-D) به محيط كشت باززايي منتقل شدند، اين نوع قند اعم از اينكه گلوكز باشد و يا ساكاروز مشخص كننده نوع اندام بوجود امده اعم از اينكه تشكيل ساقه نابجا گردد و يا جنين رويشي و يا هر دو تشكيل شوند بود (Hsia and Korban, 1996). و يا جهت القاء جنين زايي رويشي در گياه نخود (Pisum sativum L.) بهترين نتيجه در غلظت(252-504 mM);  فروكتوز بدست امد، بطوريكه تعداد جنين هاي تشكيل شده سه تا چهار برابر تيمار شاهد يعني ساكاروز با غلظت 84 ميلي مول بود (Loiseau et al. 1995). از طرف ديگر گزارش شده است كه در بعضي از مواقع بعضي از انواع قند ها از قبيل گالاكتوز، رافينوز و استاكيوز نه تنها باعث تسريع جنين زايي نميگردند، بلكه باعث تاخير در توليد جنين ها نيز ميشوند .(Verma and Dougall, 1977)

 

 

جدول : اثر كربوهيدراتهاي مختلف موجود در كشت تعليق سلولي، پيش كشت و محيط كشت جامد برروي تعداد جنين هاي رويشي تشكيل شده، در ظروف پتري، بعد از 14 روز قرار دادن برروي محيط كشت جامد، در طي )جنين زايي رويشي گياه خيار. Strolka, 1996).

محيط كشت تعليق سلولي محيط پيش كشت مرحله تمايز جنين رويشي در محيط كشت جامد (تعداد جنين هاي رويشي تشكيل شده) ساكاروز گالاكتوز فروكتوز گلوكوز ميانگين     فروكتوز ساكاروز 5/5 12 5/11 5/7 1/9 گالاكتوز 5/3 0 5/1 5/1 6/1 فروكتوز 0 0 5/0 0 1/0 گلوكوز 5/7 4 6 5/7 3/6 ميانگين 1/4 4 9/4 1/4 3/4     ساكاروز ساكاروز 17 5/21 15 5/20 5/18 گالاكتوز 17 5/18 18 17 6/17 فروكتوز 5/7 7 8 5/8 8/7 گلوكوز 15 19 5/21 5/14 5/17 ميانگين 1/14 5/16 6/15 1/15 3/15     گلوكوز ساكاروز 5/2 5/1 5/1 5/6 3 گالاكتوز 3/5 5/1 5/0 2 9/1 فروكتوز 5/0 0 0 5/0 3/0 گلوكوز 5/2 5/0 1 5/2 6/1 ميانگين 3/2 9/0 8/0 9/2 7/1     گالاكتوز ساكاروز 5/5 5/4 3 5/3 1/4 گالاكتوز الوده الوده الوده الوده - فروكتوز 0 1 2 0 8/0 گلوكوز 11 5 6 0 5/5 ميانگين 5/5 5/3 7/3 2/1 5/3 ميانگين   6/6 4/6 4/6 1/6 4/6

در بررسي كه نتايج ان در جدول 6-1 اورده شده است، تعداد جنين هاي رويشي بوجود امده يك همبستگي با نوع كربوهيدرات را نشان داد، بطوريكه ساكاروز داراي بيشترين تعداد جنين در هر پتري ديش بود و فروكتوز با 4،3 و گالاكتوز با 3،5 جنين در هر ظرف و گلوكوز با 1،7 جنين به ترتيب در مراحل بعدي قرار داشتند. در اين بررسي انواع مختلف كربوهيدرات موجود در طي پيش كشت داراي تاثيرات متفاوتي بود. در اينجا نيز ساكارز بهترين تاثير را بر تعداد جنين هاي بوجود امده در هر ظرف داشت. در اين تحقيق انواع مختلف كربوهيدرات موجود در محيط كشت جامد برروي مرحله تمايز جنين رويشي خيار، تفاوت اشكاري را نشان ندادند.

در جداول بعد ترکیب بعضی از محیط های کشت بافت و جنين زايي رويشي متداول، اورده شده است. غالبا غلظت ساکاروز موجود در این محیط های کشت بین دو تا سه درصد می باشد(Staba, 1980) . يكي از اثرات قند ها در محيط كشت جنين زايي اثر انها برروي سنتز كلروفيل در سلولهاي نمونه مورد كاشت ميباشد. بطور مثال در ازمايشاتي كه در رابطه با تاثير قند ها برروي كشت سلولهاي اسفناج انجام شده مشاهده شد كه فقط وقتي كه غلظت ساكارز محيط كشت زير 2.5 گرم در ليتر باشد سنتز كلروفيل انجام ميگردد. همچنين معلوم شد كه غلظت هاي زياد ان يعني60 تا 100 گرم در ليتر، بر سنتز كلروفيل در سلولهاي موجود در محيط كشت اثر بازدارندگي دارد. مضافا مشخص شد كه قند هاي ديگر ازقبيل گلوكوز، فروكتوز، مالتوز، اينولين و رافينوز از سنتز كلروفيل در اين گياه جلوگيري مينمايند. ساكارز تنها قندي است كه ميتوان در غلظت 20 تا 30 گرم در ليتر و بندرت در غلظت 60 گرم در ليتر جهت كشت سلولهاي اسفناج استفاده نمود(Bajaj, 1997) . در مورد ساير گياهان نيز اين مقدار ساكارز در محيط كشت جنين زايي مناسب بنظر ميرسد.

همانطور كه قبلا نيز ذكر گرديد، ظاهرا تاثير غلظت هاي زياد كربوهيدراتها بر روند جنين زايي رويشي در محيط القاء مثبت تر ميباشد  (Charriere and Hahne, 1998). در صورتيكه در زمان جوانه زني جنين ها، مقدار كمتري از انها باعث افزايش تعداد جنين هاي جوانه زده ميگردد. مانند تشكيل جنين هاي رويشي و پياز هاي كوچك از كشت بافت گياه نرين (Nerine) در محيط كشت مايع حاوي نفتالين استيك اسيد، بنزيل ادنين و پاكلوبوترازول [Paclobutrazol (PAC)]. در اين ازمايش نمونه ها از محيط كشت اوليه به محيط كشت فاقد هرگونه تنظيم كننده رشد انتقال يافتند. در نتيجه در محيط كشت كه حاوي كمترين ميزان ساكاروز بود بيشترين مقدار جوانه زني جنين هاي رويشي مشاهده شد LilienKipnis et al. 1994)). البته اين مقادير كمتر و بيشتر قند موضوعي نسبي بوده و جهت مقايسه با غلظت هاي بسيار زياد و يا بسيار كم ان بكار ميرود و با نوع گياه نيز مرتبط است. بعنوان مثال در بررسي كارير و هانه كه بر روي جنين زايي گياه افتاب گردان صورت گرفت مقدار سه درصد ساكارز با مقدار 12 درصد ان و براي همين گياه مقايسه گرديد (Charriere and Hahne, 1998). در حاليكه نتايج جدول 6-2 نشان دهنده مقايسه بين تاثير مقادير كمتر اين كربوهيدرات برروي جنين زايي رويشي گياه گرمسيري  Simarouba glauca ميباشد. بطوريكه مناسبترين غلظت ها براي اين گياه كمترين جنين رويشي را در گياه افتاب گردان (Helianthus annuus L.) بوجود اورد و در نتيجه براي افتاب گردان نامناسبترين غلظت محسوب گرديد.

 

جدول 6-2: تاثير غلظت هاي مختلف ساكاروز بر تكامل جنين هاي رويشي گياه Simarouba glauca، در كشت كالوس، در محيط كشت موراشيگ و اسكوگ (Rout and Das, 1999)

درصد ساكاروز در محيط كشت درصد كالوس جنين زا تعداد جنين هاي رويشي در هر كشت     جنين هاي قلبي شكل جنين هاي اژدري شكل جنين هاي دو لپه 1 - - - - 2 55 6/58 6/29 4/20 3 7/81 7/62 43 4/30 8-4* - - - -

* در اين غلظت هاي ساكاروز كالوس ها قهوه اي شدند.

- هيچگونه كالوس و جنيني تشكيل نشد.

 

چنانچه از جدول 6-2 برداشت ميگردد، بيشترين ميزان كالوس جنين زا و تعداد جنين رويشي در محيط كشت حاوي سه درصد ساكاروز بوجود امدند. در اينجا حضور ساكاروز در غلظت هاي كمتر از دو و بيشتر از چهار درصد در محيط كشت بر جنين زايي رويشي اين گياه تاثير بازدارنده داشت.

 

دی(-)- فروکتوز[4]

فرمول شیمیایی: C₆H₁₂O₆

وزن ملکولی: 16/180

بصورت كريستالهاي سفيد رنگي مي­باشد كه محتوي كمتر از 5/0 درصد گلوكز و كمتر از 001/0 درصد فلزات سنگين مي­باشد.

      در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب مي­باشد (20 درجه سانتیگراد/3750 گرم در لیتر).

دی- (+)- گالاکتوز[5]

فرمول شیمیایی: C₆H₁₂O₆

وزن ملکولی: 2/180

 كه داراي 1-2 درصد گلوكز مي­باشد.

      در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب مي­باشد.

 

دی- گلوکز مونوهیدرات[6]

فرمول شیمیایی: C₆H₁₂O₆.H₂O

وزن ملکولی: 17/198

بصورت كريستالهايي است كه داراي كمتر از 001/0 درصد فلزات سنگين و كمتر از8-10 درصد آب مي‌باشد.

      در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب (25 درجه سانتيگراد/820 گرم در ليتر) مي­باشد.

 

 

 

لاكتوز[7]

فرمول شیمیایی: C₁₂H₂₂O₁₁.H₂O

وزن ملکولی: 32/360

      در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب می­باشد.

 

مالتوز[8]

فرمول شیمیایی: C₁₂H₂₂O₁₁.H₂O

وزن ملکولی: 3/360

مالتوز دارای کمتر از 5/4 درصد گلوکز و کمتر از 5/5 درصد ماتوتریوز می­باشد.

      در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب می­باشد.

 

دی- مانیتول[9]

فرمول شیمیایی: C₆H₁₄O₆

وزن ملکولی: 2/182

بصورت کریستالهایی می­باشد که کمتر از 1/1 درصد سوربیتول دارد.

       در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب (20 درجه سانتیگراد/156 گرم در لیتر) می­باشد.

 

رافینوز[10]

فرمول شیمیایی: C₁₈H₃₂O₁₆.5H₂O

وزن ملکولی: 5/594

رافینوز به­صورت کریستالهایی می­باشد که کمتر از 1/0 درصد خاکستر سولفاته و کمتر از 001/0 درصد فلزات سنگین می­باشد.

      به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب (143 گرم در لیتر) می­باشد.

دی- ریبوز[11]

فرمول شیمیایی: C₅H₁₀O₆

وزن ملکولی: 1/150

دی- ریبوز ترکیبی است که دارای کمتر از 001/0 درصد فلزات سنگین نظیر سرب می­باشد.

 

نشاسته برنج[12]

      به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

 

ساكارز[13]

فرمول شیمیایی: C₁₂H₂₂O₁₁

وزن ملکولی: 30/342

كيفيت اين ساكارز در مقايسه با ساكاروز استاندارد طوري است كه دوبار كريستاليزه شده است. تصفيه مضاعف تضمين مي­كند كه عوامل رنگ دهنده طبيعي از چغندرقند حذف شده اند، بطوريكه يك قند سفيدِ بخصوص، حاصل شده است. مزيت ديگر آن اين است كه فرايند تصفيه مجدد هر گونه آلودگي آلي و غيرآلي باقيمانده را حذف مي­كند. اين نتايج در يك قند شفاف سبب توليد يك سلول بي رنگ و شفاف خواهد شد. ساكاروز دوبار كريستاليزه شده Duchefa توسط آزمايشگاهها جهت كشت پروتوپلاست و تكثير درون شيشه­اي بافتهای گياهي در آزمايشگاههاي كشت بافت به­كار مي رود.

کریستالهای بی­رنگ خشک یا پودر کریستالی سفید کمتر از 0005/0 درصد باریم، کمتر از 00005/0 درصد سرب، کمتر از 0015/0 درصد سولفیت و کمتر از 02/0 درصد سولفات می­باشد.

      به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب می­باشد. 

4-4-6- مواد معدنی غذایی

بعد از قند ، مواد معدنی ، مهمترین گروه مواد غذایی در رشد این ویترو هستند. روشهای زیادی برای چگونگی ترکیب کردن نمکهای پر مصرف و کم مصرف وجود دارد که مهمترین آنها در جدول 1 داده شده است. چوست و همکارانش ( 1986) برنامه کامپیوتری را ابداع کردند که می توان با استفاده از آن ، مقادیر نمکهایی را که برای یک محیط کشت که خصوصیات اصلی آن ( متعلقات یونی، غلظت کامل یونی PH) شناخته شده است محاسبه کرد ؛ یا بر عکس می توان با داشتن ترکیبات مقادیر نمک سایر خصوصیات محیط کشت را به دست آورد. معمولا ازمحلول آلی غلیظ ذخیره [14] برای ساختن محیط کشت استفاده می شود . اگر چه امروزه محلولهای آماده نیز در دسترس می باشند. محلولهای ذخیره باید در حرارت اتاق و در تاریکی نگهداری شوند. در تهیه محلولهای ذخیره ممکن است اضافه کردن نمکها با هم سبب تشکیل رسوب شود که برای جلوگیری از این مشکل بایستی دستورالعملهای مربوط به ساخت محلولهای استاندارد را رعایت نمود در سالهای اخیر ،  NA FE-EDTA‌( 38-25 میلی گرم در لیتر) به عنوان منبع آهن ، استفاده شده است.

انتخاب مخلوط نمکهای پر مصرف و کم مصرف ، شدیدا به گیاه مورد مطالعه بستگی دارد. کاربرد محیط کشت موراشی واسکوگ یا MS[15] به دلیل اینکه بسیاری از گیاهان به آن عکس العمل مناسبی نشان می دهند، بسیار متداول است. در هر حال باید توجه داشت که این محیط کشت الزاما همیشه برای رشد و نمو ایده آل نیست زیرا میزان نمک در  آن خیلی بالاست. به عنوان مثال گیاهان جنس جربرا[16] و Rhododendron‌و kalmia ( نپل 1985) در کشت این ویترو، به نمک حساس هستند ( پیریک و سگرد 1973) برای گیاهان حساسی مثل بعضی از گونه های چوبی للود و مک کون ( 1980) محیط کشت WPM‌ (‌محیط کشت مخصوص گیاهان چوبی)[17] را ارائه کرده اند.

 

 درهنگام انتخاب مخلوط نمکهای پر مصرف و کم مصرف باید نکات ذیل را در نظر گرفت:

1-     بعضی اوقات غلظت نهایی مهم است ( شکل 7-6) قسمت دوم جدول 1 غلظت یونها بر حسب میلی مول در لیتر می باشد. اعداد بوضوح نشان می دهند که محلول ناپ ( 1984) یک محیط کشت با نمک ضعیف و محیط کشت MS یک محیط کشت با نمک قوی است. 

2-     اگر چه بعضی اوقات از فرم آزت آلی استفاده می شود ( بخش 9-4-6) ولی معمول است که ازت حدود 12 تا 60 میلی مول در لیتر است. بیشتر گیاهان NO^-₃ را برابر NH⁺₄ ترجیح می دهند، اگر چه در بعضی موارد عکس آن هم صادق می باشد. لازم است توازن صحیح را NH⁺ / NO^-₃
برای رشد و نمو ایده آل پیدا کرد.

3-     اگر گیاه یونهای NH⁺₄ را جذب کند ، PH‌ کاهش یافته و ممکن است آگار به صورت مایع در آید و در نتیجه به علت جذب NH⁺₄ به وسیله گیاه کاهش می یابد ، و جذب ازت در فرم NO^-₃ از حجیت پیدا می کند.

4-     غلظت یونها بر حسب میلی مول در لیتر که در جدول 1 آمده بیانگر این است که نیاز K⁺ بین 2 تا 26 میلی مول در لیتر می باشد، در حالی که نیاز به  H₂po^-₄  ، Ca²⁺ ، Mg ²⁺  و SO₄^2-  کم است ( 1 تا 5 میلی مول درلیتر)

 

5-4-6- pH

درباره اثر pH‌ محیط کشت روی رشد این ویترو اطلاعات کمی وجود دارد. به نظر می رسد که pH در محدوده 5 تا 5/6 برای رشد، مناسب باشد ؛ زیرا pH های پایین ( کمتر از 5/4) و pH های بالا ( بالاتر از 7) عموما در کشت این ویترو باعث توقف رشد و نمو می شود.

اگر pH خیلی پایین باشد مسائل ذیل ، می تواند به وجود آید ( بوتنکو 1986) :

1-     اکسین IAA ‌ و اسید جیبرلیک کمتر پایدار می ماند.

2-     غلظت آگار کم ( آبکی ) می شود.

3-     احتمال رسول نمکهای خاص (‌نمکهای فسفات و آهن) وجود دارد.

4-     ویتامین B₁ و اسید پانتوتنیک کمتر پایدار می مانند.

5-     جذب یونهای آمونیوم کند می شود.

PH قبل و بعد از اتوکلاو کردن متفاوت است. اگر PH اولیه ، بین 5 تا 7 باشد؛ معمولا حدود 3/0 تا 5/0 واحد پایین می آید ( اسکیروین و همکاران 1986) در منابع کشت بافت گیاهی بندرتاز بافرها برای کنترل PH استفاده شده است. گاهی بافر فسفات سورنسون[18] به کاربرده شده است. در هر صورت کاربرد بافرهای فسفاته در اثراضافه شدن به محیط کشت باعث تغییراتی خواهد شد. انگلیش و حنان ( 1945) گزارش کرده اند که با PH برابر با 6 قسمتی از گلوکز در اثر اتوکلاو کردن به فروکتوز تغییر پیدا می کند. به نظر می رسد که تبدیل ساکارز به گلوکز و فروکتوز طی اتوکلاو کردن با PH مرتبط باشد.

در بعضی موارد از بافرهای MES [19]و TRIS [20] ( بنگا و درزان 1982)  نیز در کشت بافت گیاهی استفاده شده است. تعداد دیگری از بافرها نیز آزمایش شده اند، که به نظر می رسد ( خصوصا آنهایی که توسط گیاه تجزیه می شوند) سمی باشند.

اگر PH در طول کشت بافت گیاهی خیلی کاهش یابد، محیط کشت، رقیق می شود و لازم است محیط کشت تازه با PH‌ مطلوب آماده شود. اغلب کشت بافت خود حالتی بافری را تنظیم می کند بطوری که PH پایین به حد مطلوب می رسد. باید در نظر داشت که PH اولیه برابر 6 در حین رشد ، می تواند تا 5/5 یا کمتر از آن برسد ( اسکیروین و همکاران 1986) .

اگر در حین تهیه محیط کشت ، PH خیلی پایین یا خیلی بالا باشد، می توان بترتیب آن را NaoH یا HCL‌ ( 1 تا 1/0 مولار) رقیق تنظیم کرد.

6-4-6- پتانسیل اسمزی

پتانسیل اسمزی محیط کشت را مجموع پتانسیلهای اسمزی آگار و سایر ترکیبات ( مواد معدنی، قندها و غیره )تشکیل می دهد. محاسبه پتانسیل اسمزی محیط غذایی خیلی پیچیده است و وزن مولکولی نمکها و درجه حلالیت آنها در دو اهمیت دارند. درعمل پتانسیل اسمزی نهایی را فقط از طریق اندازه گیری می توان مشخص کرد. بدون شک قندها در مقایسه با نکهای پر مصرف اثر بیشتری روی پتانسیل اسمزی دارند. باید در نظر داشت که قند دی ساکارید ( مثلا ساکاروز ) توسط اتوکلاو کردن به دو منوساکارید تغییر می کند ( هیدرولیز می شود) و در نتیجه پتانسیل اسمزی را تغییر می دهد.

سهم قندها و نمکهای پر مصرف در وقع پتانسیل اسمزی محیط های کشت مختلف متفاوت است ( یوشیدا و همکاران 1973) پتانسیل اسمزی ( بر حسب بار ، یک بار = 10⁵ پاسکال) نمکهای پر مصرف و قند در چند محیط کشت ، بترتیب به قرار ذیل است:

 

پتانسیل اسمزی(بار)		نوع محیط کشت
قند	نمکهای پر مصرف
46/1 46/1 05/4 20/4	۰⁄٤٣ 67/0 96/0 27/2	وایت [21] هیل برانت [22] هلر موراشی و اسکوگ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

اگر  پتانسیل اسمزی بیش از حدود  ×۳  پاسکال  (برابر با ۳ بار ) باشد ، رشد و شکل گیری اندام ، براثر توقف جذب اب ، متوقف می شود (پیریک و استیگمانز۱٩٧٥) . پتانسیل اسمزی محیط کشت را تقریبا  می توان بسادگی با افزودن مانیتول٣ افزایش داد . مانیتول ، یک مادۀ غیر فعال فیزیولوﮊیکی است (گرینوود و برلین ١٩٧٣) . افزودن مانیتول[23] ،یک مولار به محیط کشت ،باید در واقع پتانسیل اسمزی٤ /٢٢- بار را حاصل نماید . امروزه از پلی اتیلن گلایکول[24] نیز برای تغییر پتانسیل اسمزی محیط کشت ، استفاده میشود .                                                                                 

7-4-6- تنظیم کننده های رشد                                                                                                                   

///////////////////////////////////////////////////////////

85- محيط كشت مورد استفاده براي كشت پروتوپلاست (كه مواد مورد نيازان بسيار بيشتر از مواد تشكيل دهنده ي محيط كشت قلمه يا كالوس مي باشد) غالبا توسط فيلتر استريل مي شود . هم در هنگام اتوكلاو كردن وهم پس از ان، بايد نكات زير، مورد توجه قرار گيرند:   

1-phمحيط كشت بين 3/. تا 5/. واحد كاهش مي يابد.

2-اتو كلاو كردن در حرارت هاي بالا، باعث قهوه اي شدن (كارامليزاسيون)قندها مي شود ،كه ممكن است اثر سمي داشته باشند.

3-اتوكلاوكردن براي مدت زمان طولاني ، باعث ته نشين شدن نمكها وتجزيه ي اگار، مي شود.

4-در مورد تنظيم دقيق مدت ودما (فشار مؤثر) بايد دقت كافي بشود. نوعي باكتري

(Bacillus stearothermophilis)مي تواند به عنوان شاخص بيولوژيكي، مورد استفاده قرار گيرد(براي اطمينان از صحت عمل استريل)اين باكتريها در مدت 12تا15 دقيقه در دماي 121 درجه سانتي گراد، ازبين مي روند.

 5-بايد در نظر داشت كه مواد فرار، دراثر استفاده از اتوكلاو، ازبين مي روند(مثل اترل واتيلن)

6-اگر نياز به شيبدار بودن سطح محيط كشت باشد(مثلا براي كشت جنين ياكشت بذر اركيده) لوله هاي ازمايش را پس از اتوكلاو كردن، بايد به صورت مايل، قرار داد.

7-توصيه مي شود در اتوكلاو، از اب بدون ملح استفاده شود .چون آب لوله كشي شهرحاوي مقادير زيادي كلسيم است كه در كف اتوكلاو رسوب كرده وتنظيم مسطح آب  وكنترل فشار  را مختل مي كند.

در سالهاي اخير، دستگاهي ساخته شده است كه مقادير مشخص محيط كشت(5/. تا16) ليتررا تهيه واستريل مي كند.در حين استريل كردن ، محيط كشت ،  به هم زده مي شود،كه درنتيجه، حل شدن مواد،   بهتر صورت مي گيرد.به هم زدن همچنين باعث سريعتر گرم شدن محيط كشت، ونهايتا سرد شدن سريعتر ان در انتهاي عمل استريل كردن مي شود.

پس از اتوكلاو كردن،مواد حساس به گرما، اضافه مي شوند،كه براي مخلوط شدن، بايد مجددا به هم زده شوند.

محيط كشت استريل شده در داخل اتاقك تميز، به لوله هاي ازمايش ،فلاسكها وظروف مشابه، منتقل مي گردد.امروزه دستگاههاي اتوماتيك تهيه واستريل كردن محيط كشت وجود دارند.

3-3-5-استريل كردن باتابش:

استريل نمودن محيط كشت توسط تابش(بااشعه ي گاما)بندرت در كشت بافت، مورد استفاده قرار

مي گيرد.زيرا در مقايسه با اتوكلاوكردن، هزينه ي بسيار بالاتري دربردارد. به نظر مي رسد اگر چه اشعه ي گاما، بخوبي اتوكلاو، عمل استريل را انجام مي دهدولي رشد گياهان درمحيط استريل شده با اشعه ي گاما، كاهش معني داري نشان مي دهد.جهت توضيحات بيشتر به كتابچه ي راهنماي استريل كردن نوشته ي فن براكت(1971)مراجعه شود.

در مورد ظروف ، جعبه هاولوله هاي پلاستيكي كه امكان استريل شدن انها با اتوكلاو وجود ندارد از اشعه ي گاما استفاده مي شود.سپس محيط كشت استريل شده در داخل اتاقك تميز،به ظروف استريل، انتقال مي يابد.  

4-3-5-استريل كردن با فيلتر:

در استريل كردن با فيلتر(محلولها،محيطهاي كشت مايع وغيره،از يك غشا، عبورداده مي شوند) كليه ي ذرات ميكروارگانيزمها وويروسهايي كه بزرگتراز قطر منافذ فيلتر هستند،حذف مي شوند. مهمترين مزيت اين روش،عبور مواد حساس به گرما(موادي كه در اثر اتوكلاو كردن تجزيه مي شوند)از فيلتر مي باشد،بدون اينكه تغييري در انها ايجاد شود.معايب اين روش عبارت است از :جذب موادتوسط فيلتر،عبور احتمالي برخي از ويروسها،وقت گير بودن وسهل نبودن كاربرد ان،نسبت به روش اتوكلاو.همه ي مشكلات اين روش در كتابچه ي فن براكت وهمكاران (1971)آورده شده است. استريل كردن با فيلتر غالبا زماني استفاده مي شود،كه نياز به يك ماده ي حساس به گرما (x)درمحيط كشت باشد. استفاده ازفيلتري باجنس استات سلولز،يا نيترات سلولز، با منافذي به قطر 22/.ميكرون،توصيه مي شود. محيطهاي كشت بدونx(ماده ي حساس به گرما)ابتدا داخل يك فلاسك، اتوكلاو مي شوندودر

حاليكه هنوز مايع هستند(دماي بين 40 تا 45درجه ي سانتي گراد)،مايعي كه حاوي ماده ي x مي باشد، توسط يك سرنگ زير پوستي كه مناسب با غشاي فيلتر است،تزريق مي شود.(اين اعمال ،در داخل اتاقك تميز، انجام مي گيرند).محيط كشت حاوي ماده ي xسپس به هم زده شده ومحيط كشت كاملي كه به اين ترتيب حاصل شده است به لوله هاي استريل شده منتقل مي گردد.امكان عبور دادن محيط كشت كامل حاوي  x نيزاز فيلتر وجود دارد.براي انجام اين عمل قبلايك پمپ خلا به فيلترهاي استريل كننده متصل مي شد.مايع تحت نيروي خلا، از يك غشا عبور كرده، و به داخل فلاسك بوخنر هدايت مي گرديدوسپس خلا توسط يك پمپ تنفسي ايجاد مي شد.امروزه محلول مورد نظر،بافشار،از فيلتر گذرانده مي شود وفشار لازم توسط فشار هوا يا سرنگ تامين مي شود.

بديهي است قسمتهاي مختلف فيلتر(گيره،صافي،سوزن وغيره)بايد قبل از استفاده، توسط اتوكلاو يا الكل96درصد،استريل شوند.

در استريل كردن با فيلتر،امكان بروز مشكلاتي وجود دارد.مثلا اگر غلظت نهايي 10 ميلي گرم در ليتربراي ماده ي Xمورد نياز باشد (از يك محلول استوك با غلظت 1000)وحلاليت ماده ي Xدر اب زياد نباشد،مشكلاتي پيش مي آيد.در اين مورد، يك ميلي ليتر از محلول استريل صاف شده حاوي 10هزار ميلي گرم در ليتر ماده ي  Xبايد به 1000ميلي ليتر از محيط كشت، اضافه شود.اين كار،به دليل عدم حلاليت ماده ي Xدرآب،امكان پذير نيست.لذا ده ميلي گرم از ماده ي Xپس از توزين، داخل اتر استريل شده وپس از بخار شدن اتر، به محيط كشت استريل، اضافه مي شود.

 

5-3-5-استريل كردن در مدرسه يا منزل

دستگاه اتوكلاو،معمولابراي استفاده در منزل يا مدرسه،بسيار گران قيمت است.ولي بجاي ان،مي توان از ديگ زودپز كه نسبتا ارزان مي باشد،استفاده نمود.محيط كشت،بخوبي درطي30دقيقه ، داخل ديگ زودپز، استريل مي شود. وحجمهاي بزرگتر مثل فلاسكهاي محتوي آب يا بسته هاي  فيلتر كاغذي براي استريل شدن به اين روش ،به60تا 70 دقيقه وقت، نيازدارند.

4-5-اتاق تهيه يااماده سازي محيط كشت

يك ازمايشگاه مجهز ،نياز به يك اتاق اماده سازي دارد،كه وسايل زير،بايددران،وجود داشته باشد:

اتوكلاو ،ماشين ظرفشويي،دستگاه يون زدايي اب، دستگاه تقطير، ظرف شويي(با شير آب گرم و سرد ). بهتر است وسايل فوق كه به نحوي با آب سروكار دارند ، در يك اتاق ، قرار گيرند . استفاده از ماشين ظرف شويي نيز قويا توصيه مي شود .چون شستشوي ظروف با دست ، وقت زيادي مي گيرد .

 فصل ششم

آماده سازي وتركيب محيط كشت

۱-۶-مقدمه

رشد ونمو گياه در محيط اين ويترو،به فاكتورهاي پيچيده ي متعددي،بستگي دارد:

1- ساختار ژنتيكي گياه

2- عناصر غذايي ،شامل آب ،عناصر پر مصرف و كم مصرف و قندها

3- عوامل فيزيكي رشد شامل نور،درجه حرارت،PH ، غلظت O2وCO2

4-بعضي مواد عالي،شامل تنظيم كننده هاي رشد، ويتامين ها وغيره

ساختار ژنتيكي گياه ،يك فاكتور حساس در هر مرحله از رشد گياه ، محسوب مي شود و به عنوان مثال چنانچه گياه دو لپه يا تك لپه باشد، نوع برگ آن متفاوت است و مشخص مي شود، چه حرارتي براي رشد

وگلدهي ان مناسب است،رنگ وفرم گل چيست،ايا گياه ميوه هاي پارتنوكارپي(بدون بذر)توليد مي كند.همچنين بروز ساختار ژنتيكي گياه ،بستگي به شرايط فيزيكي وشيميايي دارد كه بايستي در شرايط اين ويترو ان را ايجاد كرد.

عناصر غذايي براي رشد ونمو گياه ضروري است .بدون اب وعناصر غذايي معدني گياه تحت هيچ كدام از شرايط اين ويترو و يا اين ويوو  قادر به ادامه حيات نيست .

                                                                                                     

7-4-6- تنظیم کننده های رشد                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                    ١ - ۷-٤- ٦-   مقدمه        

   از نظر تعریف ،هورمونها ،ترکیبات الی هستند که بهصورت طبیعی در گیاهان عالی ساخته می شوند و روی رشد و نمو ،اثر می گذارند . هورمونها معموﻷ در نقاط مختلف گیاه ،فعال هستند.  علاوه بر این ترکیبات طبیعی ،ترکیبات مصنوعی نیز ساخته شده اند که با انواع طبیعی ،مطابقت دارند . مجموع هورمونها ترکیبات مصنوعی تولید شده ،تنظیم کننده های رشد ،نامیده می شوند . اساسا هورمونها مسوول توزیع ترکیباتی هستند که گیاه بیوسنتز می کند . این مواد ،رشد نسبی همۀ اندامها را در گیاه ،تعیین می کنند .                                                                                  

در کشت این ویتروی گیاهان عالی ،تنظیم کننده های رشد ،مخصوصا اکسینها و سیتوکینینها ،خیلی بارز هستند . در واقع ،می توان گفت که غالبا کشت این ویترو بدون وجود تنظیم کننده های رشد ،غیر ممکن است .چگونگی تصمیم در مورد اضافه کردن هورمون اکسین و یا سیتوکینین به محیط کشت جهت رشد و یا تقسیم سلولی ،بستگی به نوع قلمه و گونه های گیاهی ،دارد . به عنوان مثال ،قلمه هایی که خودشان اکسین تولید می کنند ،به اکسین اضافی برای رشد و یا تقسیم سلولی ،نیاز ندارند . همچنین در مورد قلمه هایی که سیتوکینین کافی دارند ،به سیتوکینین اضافی برای افزودن به محیط کشت ،نیازی نیست . با توجه به رشد سلولها ، بافتها ،اندامها و غیره، تقسیم بندیهای زیر را می توان انجام   داد:     87

 

                                                                                                                          

۱- کشتهایی که ،به اکسین و یا سیتوکینین ، نیاز ندارند .                                                                          

 ٢- کشتهایی که، فقط به اکسین ، نیاز دارند .                                                                               

٣- کشتهایی که ، فقط به سیتوکینین  ، نیاز دارند .                                                                           

  ۴- کشتهایی که ، هم به اکسین ، و هم به سیتوکینین ، نیاز دارند . 

برای گونه هایی که قبلا مطالعه شده ا ند ، در مورد نیاز بافتها یا اندامها ی گیاه مورد نظر ، به تنظیم کننده های رشد در محیط این ویتر ، باید تصمیم گیری شود ، و مقادیر مطلق یا نسبی تنظیم کننده های (اکسین و سیتوکینین ) مورد نیاز ، مشخص شوند .سایر تنظیم کننده ها ، مثل جیبرلین و یا اتیلن مورد نیاز باشند .            

 برای تنظیم کننده های رشد ، از محلولهای ذخیره ، استفاده می شود . برای مثال ، محلول ذخیره  ۱٠٠میلی گرم در لیتر معادل ۱٠ گرم در میلی لیتر ا ست ، و سایر غلظتهای کمتر ، از طریق رقیق کردن، به دست می اید (یک میلی لیتر از این محلول ذخیره در لیتر ، غلظت نهایی ۱٠  گرم در میلی لیتر را دارد ) چنانچه در محیط کشت به مدار بین۵ تا ۱٠٠  میلی گرم در لیتر تنظیم کنندۀ رشد نیاز با شد  ، مستقیما به صورت خشک (جامد ) اضافه خواهد شد ، زیرا نمی توان ان را از محلول ذخیره ، به دست اورد .                                                             

 بعضی ا وقات ، در هنگام حل تنظیم کننده ها در اب ، مشکلاتی پیش می اید . توصیه می شود که  ،،  به صورت نمک پتاسیم که بیشتر محلول است ، به کار روند NAA ﻭIBA، IAA همچنین می توان این سه اکسیژن را به کمک پتاسیم هیدروکسید (پتاس) یا سدیم هیدروکسید (سودسوزآور) ،  ۱/٠ مولار حل می شوند .سیتو کینینها نیز معمولا به کمک KOH  یا NaoH   ، 1/0 مولار حل می شوند.  این ،  در حالی است که جیبرلینها را می توان با تکان دادن شدید[25]  در ا ب حل نمود .                   88

محلولهای ذخیرۀ IAA و کینتین را باید در تاریکی نگهداری کرد ؛ زیرا در نور ، غیر پایدار هستند . در نتیجه،این دو تنظیم کننده در محیط کشت به وسیلۀ نور ، تجزیه می شوند . IBA  ، NAA ، D – 4 و 2 و  BA  (سیتو کینین) در نور پایداری بیشتری دارد . نگهداری طولانی  تنظیم کننده های رشد سبب بروز مشکلات بعدی می شود . به عنوان مثال IAA  در حالت محلول ،بتدریج غیر فعال می شود ، همچنین IAA  براحتی به وسیلۀ انزیمهایی نظیر (پراکسیداز، IAA  اکسیداز ) تجزیه می شود .

اسامی و فرمول تنظیم کننده ها در شکل (۶-۸) اورده شده است ، و در این بخش، فقط توضیحات مختصری، از مهمترین اثرات انها ، داده می شود . 

 

چنانچه در کشت بافت، از تنظیم کننده های رشد  ، خصوصا اکسین و سیتوکینین ، استفاده شود ؛ گاهی اوقات ، سازگاری[26] (عادت ) پیش می اید . سازگاری ، پدیده ای ا ست که در ان ، در کشت این ویترو (که در ا بتدا به تنظیم کننده برای رشد و یا شکل گیری اندام  ، نیاز دارد ) بعد از مدتی ( چند واکشت( [27] دیگر نیازی به تنظیم کننده ها نداشته و تا به تنظیم کنندۀ کمتری نیاز می باشد . این حالت ، اغلب در کشت کالوس و همچنین در مورد تشکیل جوانه های جانبی گونه Vriesea  تحت تاثیر سیتوکینین ، به وجود می اید . بطور کلی ، سازگاری  ، یک تغییر دایمی نیست ، بطوری که اگر گیاهانی از بافتهای سازگار شده و ریز نمونه ها ایزوله شوند ، این نم.نه ها برای رشد مجدد ، به تنظیم کننده های رشد ، نیاز خواهند داشت . به عبارت دیگر ، تغییرات سازگاری در ماهیت اپی ﮊنتیک  [28]( تغییرات در فعالیت ﮊن در مراحل مختلف رشدی گیاه – تنوع محیطی – اکتسابی ) هستند . با این وجود ، مورگان

( ۱۹۸۶) تئوریی ارائه کرده ا ست که طبق ان ، اعتقاد دارد در بعضعی موارد ، سازگاری توارثی ا ست ، و ماهیت اکتسابی ندارد .                                                                                                                      

به نظر می رسد در بعضی موارد (مثلا تشکیل ساقه های جانبی در خانوادۀ Bromeliaceae ) جداسازی نوک ساقه [29] از یک گیاه بالغ بعد از چند واکشت ، دارای اثر تجدید جوانی[30] ا ست . این تجدید جوا نی به کاهش نیاز مجدد به تنظیم کنندۀ رشد ، منجر می شود ؛ که در هر حال ، با پیر شدن کشت، برگشت  می کند بنابراین، پدیدۀ تجدید جوانی ، تشابهاتی با پدیدۀ سازگاری ، دارد .  

 

                                                                                            

۶-۴-۷-۲-اکسین                                                                                                    

اکسین (IAA  ، IBA  ،NAA ، D – 4 و 2) غالبا به محیط کشت  ، اضافه می شود . اکسین طبیعی IAA  معمولا با غلظت 10- 01/0  میلی گرم در لیتر ، اضافه می شود . اکسینهای مصنوعی  و نسبتا فعا لتر (IAA  ، NAA  وتو، فور - دی ) در غلظت  001/0 تا  ۱۰ میلی گرم در لیتر به کار می روند . در شکل  ۶-۹   اثر غلظتها ی بالای یک اکسین ضعیف (IAA ) با غلظت کم یک اکسین قوی(NAA )  مقایسه شده ا ست . اکسینها  ، معمولا باعث رشد طولی سلول، تورم بافتها ، تقسیم سلولی (تشکیل کالوس ) و تشکیل ریشه های نابجا ، مما نعت از تشکیل شاخه های نابجا و جانبی، و غالبا جنین زایی[31]  در کشتهای سوسپانسیون ، می شوند. در غلظت کم اکسین ، تشکیل ریشه های نابجا ، حالت غالب دارد . در حالی که در غلظت زیاد اکسن ، تشکیل ریشه صورت نمی گیرد ، و تشکیل کالوس اتفاق می افتد . استفاده از تو ، فور-دی  باید حتی ا لمقدور محدود شود زیرا می تواند باعث موتاسیون شود . از طرف دیگر  تو ، فور- دی  می تواند مانع از فتوسنتز شود . این در حالی ا ست که در ا ستفاده از اکسینهایNAA ، IBA و IAA چنین اتفاقی نمی افتد .  در بعضی موارد ، اضافه نمودن اکسین ، سبب تسریع رشد گیا هچه  می شود .پیریک و همکاران (۱۹٨۴) نشان داده اند که  NAA سبب تسریع در ریشه دهی گیا هچه های گزینش شده از خانواده Bromeliaceae  می شود ، که در نتیجۀ ان ، گیا هان ، شروع به رشد می کنند (شکل ۶-۱۰)         

 

۳-٧-۴-۶- سیتوکینین                                                                                                                

سیتو کینینها غالبا برای تحریک رشد و نمو ، به کار می روند؛ کینیتین، BA ،  2ip وPBA  استفادۀ متداول دارند . این هورمونها ، بوﯾﮊه اگر توام با یک اکسین اضافه شوند (شکل ۱۱-۶) باعث تحریک تقسیم سلولی میشوند . در غلظتهای بالا (۱-۱۰ میلی گرم در لیتر ) باعث تشکیل ساقۀ نابجا می شوند ؛ اما معمولا از تشکیل ریشه مما نعت می شود . انها از طریق کم کردن چیرگی ا نتهایی باعث تحریک تشکیل ساقۀ نا بجا ( شکل ۶-۱۲) و عقب افتادگی پیری، می شوند .                                                                                                                       

۴-٧-۴-۶- جیبر لینها                                                                                                                          

معمولا این گروه از ترکیبات ، در کشت این ویتروی گیاهان عالی ، به کار نمی روند . به نظر می رسد که این مواد در بسیاری موارد ، برای کشت این ویترو ، لازم نیستند . GA₃ بیشتر از همه مورد استفاده قرار می گیرد ، اما باید در نظر داشت که خیلی به حرارت حساس ا ست ، به نحوی که بعد از اتوکلاو کردن ۹۰   درصد از فعالیتهای بیولوﮊیکی ان  ، از بین می رود (وان بوات و همکاران ۱۹٧۱) . بطور کلی ، جیبرلینها در کشت این ویترو  ، باعث رشد طولی میانگره ها و رشد مریستم یا جوانه ها ، می شوند . انها ممکن ا ست باعث شکستن خواب  جنینهای ایزوله شده یا بذرها هم  ، بشوند .جیبرلینها ، معمولا سبب ممانعت از تشکیل ریشۀ نابجا (شکل ۶-۱۳) و همینطور تشکیل ساقۀ نابجا می شوند (پیریک و استیگمنز a۱۹٧۵) .  

    ۵-٧-۴-۶- سایر تنظیم کننده ها                                                                                                            

 

اولیگوساکارینها                                                                                                                                       

 اخیرا کشف شده ا ست (البرشیم و لارویل ۱۹۸۵؛ البرشیم و همکاران ۱۹۸۶) که اولیگوساکارینها (از نظر ساختمانی ، قطعاتی از پلی ساکاریدهای دیوارۀ سلولی  ، محسوب می شوند .) پیام رسانهای شیمیایی ، با خصوصیات تنظیم کنندگی خاص هستند .اولیگوساکارینها به وسیلۀ  انزیمها   ، از دیواره های سلولی ، ازاد می شوند . اولیگوساکارینهای مختلف، می توانند نه تنها به عنوان سیستم دفاعی گیاه علیه عوامل بیماریزا و سایر انواع تنشها ، بلکه از طریق تنظیم رشد گیاهی و تمایز داخل ریشه ها ، گلها و جوانه های رویشی ، به عنوان تنظیم کننده نیز عمل کنند .   

 

95

                                                                                                                            

ا سید ا بسیک                                                          

در بسیاری موارد ، کشت این ویترو ABA با اثر منفی مواجه بوده ا ست (پایلت و دولند ۱۹٧۱) (شکل ۶-۱۴) و گزارشهای موجود مبنی بر تحریک رشد کالوس و جنین زایی ان ، احتمالا اتفاقی ا ست (ا میرراتو ۱۹۸۳).        

 اتیلن                                                                               

مشخص شده ا ست که کشت اندام نیز همانند کشت کالوس  ، قادر به تولید هورمون گازی اتیلن می باشد  (ملی و همکاران ۱۹۸۲) . از ان جایی که در بعضی موارد لوله های ازمایش ، فلاسک و خصوصا ظروف پلاستیکی کاملا بسته می شوند ؛ باید مراقب بود که تجمع اتیلن  ، حادث نشود . از طرف دیگر ، ظروف پلاستیکی نیز تولید اتیلن می کنند ، که بایستی در هنگام استفاده از انها ، مواظبتهای خاص ، اعمال شود . روشن کردن کبریت و ایجاد شعله نیز  ، تولید اتیلن می کند ، لذا نباید این عمل را در داخل محفظه با جریان هوای استریل (اتاقک تمیز ) انجام داد . ملی و همکاران (۱۹۸۲) اثر روشهای مختلف بستن درب ظروف مورد استفاده در کشت این ویترو را  ، روی رشد سرشاخه های میخک ، بررسی و نتیجه گیری کرده اند که در اثر بستن درب ظروف  ، تجمع اتیلن ، اتفاق می افتد ، و منجر به ممانعت از رشد ، می شود . اگر KMnO₄  اضافه شود ( در یک لولۀ جداگانه ) در این صورت  ٧۰   درصد از اتیلن می تواند حذف شود .                                                                                                

در منابع علمی ، گزارشات متفاوتی در مورد نقش اتیلن در اندام زایی وجود دارد . موارد بی اثر بودن اتیلن روی جنین زایی و در بعضی موارد  ، اثر مثبت ان ، گزارش شده ا ست . در یک ازمایش ، ملاحظه شد که وقتیکه کالوسهای توتون در نور رویانیده شدند (هاکستر و همکاران ۱۹۸۱)  ، تولید اتیلن ، در حالتی که شاخه های نابجا تشکیل شدند ، همچنین نتایج این ازمایش ، نشان داد که تشکیل اتیلن ، بستگی به دورۀ زمانی بعد از واکشت (اتیلن بیشتری در ۵  روز اول ، نسبت به ۶  تا  ۱۰  روز بعدی ، تولید شد)  و در رﮊیم نور / تاریکی (اتیلن بیشتری در تاریکی نسبت به روشنایی تولید شد )دارد . نامبردگان نتیجه گیری کرده اند که اتیلن در طول ۵   روز اول کشت ، جنین زایی را کاهش می دهد ، در حالی که تمایز ساقه (بطور قابل رویت ) در  ۶ تا ۱۰ روز بعد از کشت ، تسریع شد  وان ارتریجک (۱۹۸۴)، و وان ارتریجک و همکاران (۱۹۸۶) نشان داده اند که با تولید گیاه جدید از قلمۀ لاله ، تولید اتیلن و اتان ، به همان اندازه که بستگی به مرحله ای که رشد مجدد در حال انجام ، دارد ؛ بستگی به شرایط رشد نیز دارد . با توجه به تولید اتیلن بیشتری در دو هفتۀ اول کشت ، تعداد پیازهای نابجا، به نظر بیشتر بود . بنابراین ، به نظر می رسد که اتیلن (بیوسنتز اتیلن ) نقش مهمی را در تشکیل پیازهای نابجا ، دارد . زمانی که بیوسنتز اتیلن در لاله توسط  [32]AVGوقف شد ، تشکیل پیاز نابجا نیز متوقف شد . افزایش اتیلن (  ۱ تا  ۱۰ پی پی ام ) طی۳   تا ٧  روز در دورۀ رشد ، تشکیل پیاز نابجا را تسریع می کند ، به همان گونه که افزایش  [33]ACCاین عمل را انجام می دهد .

همچنین  ، به نظر می رسد که اتیلن روی جنین زایی و تشکیل اندام در بازدانگان  ، اثر دارد  ، ورهگین و همکاران(۱۹۸۶) نشان  داده اند که کالوس غیر جنینی در گیاهpicea abies   ،  ۱۰ برابر بیشتر از کالوس جنینی  ، اتیلن تولید می کند .کومار و همکاران ( ۱۹۸۶) نشان دادند که تجمع اتیلن و  Co₂      در طولاولین هفتۀ کشت در فلاسکهای ارلن مایر  ، تشکیل شاخه های نابجا را در کوتیلدونهای جداشدۀ کاج  ( Pinus radiate ) تسریع می کند . زمانی که اتیلن و Co₂ از فلاسکهای حذف شده  ، رشد مجدد ساقه و نیز متوقف شد .                     97  

 در بعضی موارد   ، رشد در محیط این ویترو  ، می توا ند به وسیلۀ اتیلن  ، تسریع شود (ا ستوتیمایر و برایت  ۱۹٧۰؛ پالمر . بارکر ۱۹٧۳؛ مکنزی و ا ستریت ۱۹٧۰ و بوریکت ۱۹٧۲). به نظر می رسد که غلظت خاصی از اتیلن برای ایجاد تقسیم سلولی ، ضروری است ، مکنزی و استریت (۱۹٧۰) در کشتهای سوسپانسیون سلولی افرا  ( Acer )  مشاهده کردند که تو  ، فور –دی باعث تشکیل اتیلن می شود .      

 

 

8- 4 – 6 – ویتامینها                98

در بعضی موارد ، از یک یا چند ویتامین ذیل ، در کشت این ویترو استفاده می شود ( اسامی دیگر آنها و غلظتهای به کار برده شده بر حسب میلی گرم در لیتر ، در داخل پرانتز ، آمده است ) :

اینوسیتول ( میو اینو سیتول ، مزو اینوسیتول ، 100 تا 200 ) ، ویتامین B₁ ( تیامین ، آدنوزین : 1/0 تا 5 ) ، کلسیم پانتوتناب یا اسید پانتوتنیک ( 5/0 تا 5/2 ) ، اسید فولیک ( ویتامین M ، 5/0 تا 1 ) ؛ ریبوفلاوین ( لاکتوفلاوین ، ویتامین B₂ ، 1/0 تا 10 ) ؛ اسید اسکوربیک ( ویتامین C ، 1 تا 100 ) ؛ اسیدنیکوتینیک ( وی تامین PP ، نیاسین ، 1/0 تا 5 ) ؛ پیریدوکسین ( آدرمین ، ویتامین B₆ ، 1/0 تا 1 ) بیوتین ( ویتامین H ، 01/0 تا1 ) ؛ پاراآمینواسید بنزوییک ( 5/0 تا 1 ) ؛ توکوفرول ( ویتامین E ، 1 تا 5 ) .

غلظت بالای اسید اسکوربیک که بعضی موارد اضافه می شود ، به این معنا نیست که گیاه چنین نیاز بالایی دارد . ویتامین C در غلظت بالا ، به عنوان آنتی اکسیدان ، به کار می رود . بسیاری از گیاهان قادرند که ویتامینها را در حالت این ویترو ، سنتز کنند ؛ و این موضوع مورد سوال است که آیا واقعاً همیشه افزودن مداوم مخلوط ویتامینها طی کشت این ویترو ضرورت دارد .

 

 

9 – 4- 6- سایر مواد متفرقه

پلی آمینها

آزمایشات نشان می دهد که پلی آمینها در جریان جنین زایی در تمایز سلولی و نمو دخالت دارند بطوری که اساساً میزان پلی آمینهای درونزا ، خصوصاً پوترسین و اسپرمیدین در طول تشکیل جنین در هویج افزایش پیدا می کند . جنین زایی ، با افزودن ممانعت کننده های سنتز پلی آمین متوقف شده ، و با افزایش مجدد پوترسین ، اسپرمیدین ، برگشت پیدا می کند .

اثرات مشابهی نیز در یونجه (Medicage sativa) گزارش شده است ( شفیدر و مکنذی 1986). روگینی و وانگ ( 1986 ) دریافته اند که پلی آمینها کوفاکتورهایی برای تشکیل ریشه های نابجا ، هستند . نکته جالب دیگر ، این که پوترسین قادر به تطابق ( همزمان کردن رشد ) مرحله
جنین زایی در هویج (Daucus carota) است ( برولی و همکاران 1985) .

بنابراین ، می توان نتیجه گیری نمود که پلی آمینها و آنزیمهای وابسته به آنها در کنترل رشد و نمو گیاهی ، اهمیت دارند . به نظر می رسد که ال- آرژانین[34] پیش ساز پوترسین باشد و پلی آمینها می توانند تبدیل متیونین به اتلین را متوقف سازند . این مطلب حاکی از نوعی سیستم کنترلی است که در آن ، اتلین ، آرژنین و پلی آمینها ، نوعی نقش تداخلی[35] را در کنترل سوماتیکی جنین زایی  بازی می کنند . 

فنیل اوره و مشتقات آن                 99

از زمانی که کشف شد [36]DPU فعالیت سیتو کینینی دارد مشخص شد که بسیاری از مشتقات اوره نیز در سیستمهای مختلف آزمون حیاتی[37] فعالیتهای سیتو کینینی اعمال می کنند ( مک و همکاران 1986 ) . برعکس هورگان (1986 ) معتقد است که DPU سیتوکینین اکسیداز را ممانعت می کند ، و ظاهراً باعث افزایش فعالیت سیتوکینینی می شود . در هر صورت مسلم است که ترکیبات بالا خصوصیات خاص خود را نشان می دهند که در این زمینه نیاز به تحقیقات بیشتری می باشد .

به نظر می رسد که فعالیترین ترکیبات پیریدیل اوره و تیدیازول اوره ( تید یازو رون و مشتقات آن) باشند که حدود 10000 برابر از DPU فعالترند و از سیتوکینینهای طبیعی نوع آدنین مثل زاتین هم فعالتر هستند . گزارش شده است که تیدیازورون شاخه دهی را در تعدادی از گونه های چوبی تحریک می کند در حالی که [38]CPPU باعث افزایش زیادی در تعداد شاخه های آزالیای خزان دار می شود ( رید و همکاران 1986 ) .

هیروکرنش (1986 ) نیز دریافتند که تیدیازورون باعث افزایش شاخه در celtis occidentalis می شود . غلظتی در حدود 05/0 تا 1/0 میکرو مولار تیدیازورون فعالتر از 4 تا 10 میکرومولار BA می باشد .

 یک مورد جالب در درخت تبریزی مشاهده شده است . روزلی و مک کون (1986 ) نشان دادند که تیدیازورون ( در غلظتی کمتر از 1/0 میکرومولار ) قادر به ایجاد شاخه های ( ساقه های ) نابجا در کالوسهای تبریزی است که کاربرد BA فقط تعدادی شاخه به دست آمد . در هر حال ، جالب توجه است که تشکیل شاخه جانبی در تبریزی ، شدیداً در تمام تیمارهای تیدیازورون متوقف می شود و لازم است که کشتهای مولد شاخه را برای نمو شاخه به محیط فاقد تیدیازورون منتقل کرد .

 

مخلوط ترکیباتی که منشأ گیاهی دارند

در این مورد ، می توان مواردی را مثل شیرنارگیل ( مایع اندوسپرم نارگیل ) ، آب پرتقال ، آب گوجه فرنگی ف آب انگور ، آب اناناس ، شیره درخت غان ، پورۀ موز ، و غیره نام برد . در عمل استفاده از این مخلوطها در مواقع تحقیقاتی بایستی احتراز شود ، زیرا :

1 – ترکیب آنها ، تقریباً یا کاملاً ناشناخته است .

2 – ترکیب آنها ، خیلی متغیر است به عنوان مثال ، شیر نارگیل ( به صورت رقیق شده 50 تا 150 میلی لیتر در لیتر ) نه تنها بین نارگیلهای جوان و پیر متفاوت است ؛ بلکه حتی بین نارگیلهای همسن نیز تفاوت دارد .

کار با شیر نارگیل ، نتایج شگفت آوری داشته است . استفاده توأم آن با اکسین شدیداً باعث تقسیم سلولی در بافتها شده است ( استوارد 1985 ) . کوو ورد (1962 ) نشان داده سات که شیر نارگیل حاوی ترکیبی شبیه کینتین ( یک سیتو کینین ) است . ستهام ( 1974 ) معتقد است که نارگیلهای رسیده ، حاوی نوعی سیتوکینین بنام نه – بتا – دی – ریبوفورانوزیل زآتین[39] است .

استادان و درویس (1975 ) وجود زآنتین و زآنتین ریبوزید را گزارش کرده اند . بطور کلی اصل مطلب این است که می توان بجای شیرنارگیل ، از سیتوکینین ، استفاده نمود .

ﻫ- شير نارگيل

در كارهاي اوليه اي كه برروي كشت بافت انجام ميشد، شير نارگيل يكي از مواد مهم تشكيل دهنده محيط كشت بود. اين ماده امروزه اهمیت اولیه خود را در کشت بافت از دست داده است ولی هنوز استفاده از ان در محيط غذايي نمونه هایی که بسختی قابل کشت می باشند، ارزش زیادی دارد. در بررسي كه كشت دو رقم ژاپني و هندي.برنج Oryza sativa، توسط دو روش كشت ميكرو (liquid droplet and shallow-layered culture) مقايسه شد، مشخص گرديد كه براي جنين زايي درون شيشه اين گياه بايستي چهارده اسيد امينه و شير نارگيل به محيط كشت افزوده گردد (Zhao et al. 1998). در تحقيقي منتشر نشده كه اخيرا توسط ممقاني و همكاران برروي كالوس زايي يك نوع از درخت نارون (Ulmus parvifolia) انجام شد نيز بيشترين ميزان كالوس در مقايسه با ساير سيتوكينين ها، در محيط كشت حاوي شير نارگيل بدست امد. لذا در حال حاضر نيز در کشت کالوس اغلب گياهان افزودن حدود 10 درصد حجمی و يا بيشتر شیره نارگیل به اغلب محیط های کشت معروف و متداول نتیجه رضایت بخش به همراه دارد. شیره نارگیل ابتدا با سوراخ کردن پوسته سخت ان خارج گردیده و پس از عبور از یک صافی در اتوکلاو استریل و يا بمدت 10 دقيقه جوشانيده می گردد. جهت استفاده بعدی از این ماده بلافاصله بعد از اتوکلاو کردن و زمانی که مایع مذکور هنوز داغ می باشد، در ظروف استریل ریخته شده و در دمای منفی بیست درجه سانتيگراد سرد و نگهداری می شود. در زمان استفاده مجدد، شیره نارگیل یخ زده در حمام اب گرم با دمای 60-70 درجه سانتیگراد ذوب شده و بعد از اتوکلاو کردن محیط کشت به ان اضافه می شود.

 

مخلوط ترکیبات ازت دار و حاوی ویتامینها  101

از ترکیبات ذیل و نیز اسیدهای آمینه ، به عنوان منابع آلی آزت دار استفاده شده است . هیدرولیزات – کازیین ( 1/0 تا 1 گرم در لیتر ) ، ( پیتون 25/0 تا 3 گرم در لیتر ) ، ( ترپیتون 25/0 تا 2 گرم در لیتر ) و عصاره مالت ( 5/0 تا 1 گرم در لیتر ) . این مخلوطها خیلی پیچیده و حاوی ویتامینها و نیز اسیدهای آمینه هستند . از عصارۀ مخمر (25/0 تا 2 گرم در لیتر ) نیز به علت کیفیت بالای ویتامینهای ب استفاده شده است . شکل 15 – 6 تحریک رشد گیاهچه ارکیده را توسط پیتون و تریپون نشان می دهد .

عصاره مالت[40]

توسط عصاره گیری از محصولات قابل حل از غله خیسانده شده تهیه می­شود که درصد ازت کل آن در حدود 1/1 وزنی، آمینو نیتروژن حدود 6/0، کلرید سدیم حدود 1/0 بوده و pHمحلول 1 درصد آن 6/5 می­باشد.

      در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب می­باشد.

پپتون[41]

پپتون مخلوطی از پپتیدها و آمینواسیدهای آزاد می­باشد که از هیدرولیز سلولهای پانکراس بافتهای جانوری به دست می­آید و به دلیل محتوای کم نمک در آن، این قابلیت برای کشت بافتهای گیاهی مناسب می­باشد.

  در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

  قابل حل در آب می­باشد.

پپتون واتر[42]

هر لیتر پپتون واتر شامل 10 گرم پپتون، 5 گرم کلرید سدیم بوده و pH نهایی آن در 25 درجه سانتیگراد، 2/0+-2/7 می­باشد.

پپتون واتر بافری دهیدراته نیز وجود دارد که دارای بافر فسفات سنگین بوده و هر لیتر آن شامل10 گرم پپتون، 10 گرم بافر فسفات، 5 گرم کلرید سدیم است و pH نهایی آن در 25 درجه سانتیگراد، 2/0+-2/7 می­باشد.

علاوه بر ترکیبات پپتونی فوق، در هر لیتر پپتون واتر بافری دهیدراته دارای بافر فسفات سبک،10 گرم پپتون، 10 گرم بافر فسفات، 5 گرم کلرید سدیم وجود دارد و pH نهایی آن در 25 درجه سانتیگراد، 2/0+-2/7 می­باشد.

  در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

  قابل حل در آب می­باشد.

 

اسیدهای آمینه به عنوان منبع آزت        102

در محیطهای کشت جدید که معمولاً توازن مناسب  به  نیاز به آزت را تضمین می کند نیازی به استفاده از اسیدهای آمینه به عنوان یک منبع آلی آزته نیست . قبلاً به دلیل عدم کفایت نسبت     به  اسیدهای آمینه ( یا مخلوطی از اسیدهای آمینه ) اضافه می شدند  –L گلوتامین متداولترین منبع آزت است ، اگر چه از آدنین و آسپاراژین هم ، احتمالاً می توان استفاده کرد .

 

 

آدنین ( سولفات )

آدنین ، برای اولین بار توسط اسکوگ و توی (1984 ) در رشد ساقه ریز نمونه های توتون به کار برده شد ، و باعث تحریک تشکیل شاخه نابجا شد . نیچ و همکاران ( 1967 ) نیز از آدنین برای تسریع در تشکیل شاخه های نابجا استفاده کردند . برای تکثیر رویشی گیاهان این ماده به صورت آماده شده ، به محیط کشت اضافه می شود ( در غلظتهای 2 تا 120 میلی گرم در لیتر به کار
می رود ) . از سولفات آدنین ، می توان بجای آدنین استفاده کرد ؛ چون در آب بیشتر حل می شود .

آدنين همي سولفات[43]

فرمول شیمیایی: C₅H₅N₅.1/2H₂SO₄

وزن ملکولی: 17/184

يك تنظيم كننده رشد سيتوكينيني مي باشد.

      قابل حل در آب مي باشد.

      نگهداري پودر: در دماي معمولي اتاق.

      نگهداري مايع: در  0-5 درجه سانتيگراد.

      استرليزاسيون: قابل اتوكلاو كردن.

      غلظت ميلي گرم در ليتر:50-250.

 

اِل-گلوتامیک اسید[44]

فرمول شیمیایی: C₅H₉NO₄

وزن ملکولی: 1/147

                                                  در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                                                  قابل حل در آب مي­باشد.

 

اِل-گلوتامین[45]

فرمول شیمیایی: C₅H₁₀N₂O₃

وزن ملکولی:15/146

كه داراي كمتر از 3/0 درصد آمينو اسيدهاي خارجي و كمتر از 001/0 درصد فلزات سنگين مي­باشند.

      در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

       قابل حل در آب (25 درجه سانتيگراد/ 5/42 گرم در ليتر) مي باشد.

 

گلوتاتون[46]

فرمول شیمیایی: C10H17N3O6S

وزن ملکولی: 33/307

که دارای کمتر از 001/0 درصد فلزات سنگین می­باشد.

      در درجه حرارت 0- 5 درجه سانتیگراد قابل نگهداري ميباشد.

 

گلایسین[47]

فرمول شیمیایی: C₂H₅NO₂

وزن ملکولی: 07/75

      در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب (25 درجه سانتيگراد/ 250 گرم در ليتر) مي باشد.

 

اِل- هیستیدین[48]

فرمول شیمیایی: C₆H₉N₃O₂

وزن ملکولی: 2/155

                 در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                 قابل حل در آب (25 درجه سانتيگراد/ 6/41 گرم در ليتر) مي باشد.

 

[49]اِل- ایزولوسین[50]

فرمول شیمیایی: C₆H₁₃NO₂

وزن ملکولی: 2/131

                 در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                 قابل حل در آب (20درجه سانتیگراد/1/0 گرم در میلی لیتر) می­باشد.

 

اِل- لیزین استات[51]

فرمول شیمیایی: C₆H₁₄N₂O₂.C₂H₄O₂

وزن ملکولی: 20/206

                 در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                 قابل حل در آب می­باشد.

 

اِل- لیزین HCl [52]

فرمول شیمیایی: C₆H₁₅CIN₂O₂

وزن ملکولی: 65/182

                 در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                 قابل حل در آب می­باشد.

 

اِل- پرولین[53]

فرمول شیمیایی: C₅H₉NO₂

وزن ملکولی: 13/115

در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

  قابل حل در آب (25 درجه سانتیگراد/1623 گرم در لیتر) می­باشد.

 

 

[54]اِل- متیونین[55]

فرمول شیمیایی: C₅H₁₁NO₂S

وزن ملکولی: 21/149

                                                  در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                                                  قابل حل در آب (20 درجه سانتیگراد/48 گرم در لیتر) می­باشد.

 

 

 آدنوزين[56]

فرمول شیمیایی: C₁₀H₁₃N₅O₄

وزن ملکولی: 2/267

      در 0-5 درجه سانتيگراد قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب مي باشد.

 

 

آدنوزين-5-تري فسفات[57]

فرمول شیمیایی:  C₁₀H₁₄N₅O₁₃P₃Na₂.3H₂O

وزن ملکولی: 19/605

      به صورت خشك در 0-5 درجه سانتيگراد قابل نگهداري ميباشد.

      در آب 20 درجه سانتيگراد به ميزان 1/0 گرم در ليتر قابل حل مي باشد.

 

 

زغال فعّال

زغال فعّال ( در غلظت بین 02/0 تا 3 درصد وزن به حجم ) از سوختن چوب در حرارت بالا و در حضور بخار تولید می شود . این ماده دارای شبکه های زیادی از منافذ با سطح داخلی بزرگی است که روی آن تمام مواد ( گازها ترکیبات جامد ) می توانند جذب شوند ( اغلب از نوع شماره 2186 ساخت کارخانه مرک استفاده می شود ) . به منظور خارج ساختن هر گونه ناخالصی زغل فعال را خالص می کنند .

توصیه می شود که زغال گیاهی به کار رود ؛ زیرا که در مقایسه با زغال حیوانی درصد زغال فعال خیلی بالا ( بین 95 تا 99 درصد ) است . مهمترین نکات مربوط به زغال فعال عبارتند از :

1 – جذب پیگمانهای ( ترکیبات شبه فنلی و ملانین ) سمی قهوه ای و یا سیاه و سایر ترکیبات ناشناخته غیر رنگی . زغال فعال ، همچنین قادر به جذب مواد سمی موجود در موز است .              

2 – جذب سایر ترکیبات آلی ( اکسین ، سیتوکینین ، اتلین ، ویتامینها ، شلاتنهای آهن ، روی ، و غیره ) که این موضوع در بررسی انجام شده توسط میسون و همکارانش ( 1983 ) ارائه شده است . جانسون ( 1983 ) معتقد است که زغال فعّال ABA را جذب می کند .                      103

3 – تغییرات نوری « محیط نوری[58] » محیط کشت ( تاریک نمودن محیط کشت ) می تواند تشکیل ریشه و رشد را تحت تاثیر قرار دهد . ( کلاین وباپ 1981 ) .       104

4 – زغال فعّال می تواند جنین زایی غیر جنسی ( امیراتو 1983 ) و جنین زایی کشت دانه گرده شقایق نعمانی (Anemone) و تنباکو (Nicotiana) ( جانسون 1983 ) را تحریک کند . اورز ( 1984 ) و بسیاری از محققّین دیگر نشان داده اند که افزایش زغال فعّال ، غالباً باعث تشدید رشد و اندام زایی گونه های چربی می شود اثرات مفید زغال فعّال شده در تولید پیازچه گونۀ   Muscatia armeniacum نیز مشخص شده است ( یک وکومینگ 1986 ) .

5 – زغال فعّال شده pH را تثبیت می کند ( هیژن و همکاران 1983 )

6 – امکان دارد زغال فعّال موادی را تولید نماید که رشد را تحریک کند . البته این موضوع ، نیاز به بررسی دارد .

بعضی از گیاهان در اثر زخمی شدن این خصوصیت غیر مطلوب پیدا می کنند که رنگدانه های قهوه ای یا سیاه ترشح می نمایند ( معمولاً ترکیبات شبه پلی فنل اکسیده شده و تاننها ، که رشد و نمو را غیر ممکن می سازد ) از تولید این ترشحات می توان به صورت دیل ممانعت نمود ( آنونیموس a 1978 ؛ کامتون و پریس 1986 ) :

1 – افزودن زغال فعّال ، به محیط کشت ( غلظت بین 2/0 تا 3 درصد وزن به حجم )

2 – افزودن PVP به محیط کشت ( غلظت بین 250 تا 1000 میلی گرم در لیتر ) PVP یک پلی مر است که مواد شبه فنلی را جذب می کند ( جانسون 1983 ) .

3 – افزودن مواد ضد اکسیدان مثل اسید سیتریک ، اسید آسکوربیک ، تیواوره یا السیتیین . این ترکیبات ، اکسیداسیون فنلها را مانع می شوند .

4 – افزودن دی اتیل – دی تیوکربنات (DIECA) در مرحله شستشو بعد از استیلیزاسیون با غلظت دو گرم در لیتر ، و یا به صورت قطراتی در زمان قرار دادن قلمه ها در محیط کشت ، می تواند عمل اکسید اسیون را مانع شود ( جونارد 1986 ) .

5 – افزودن سه اسید آمینه گلوتامین ، آرژانین و آسپاراژین .

6 – در بعضی موارد ، واکشت مداوم روی محیط کشت تازه به ارامی تشکیل رنگدانه ها را متوقف می سازد .

7 – استفاده از محیط کشت مایع که در آن حل شدن مواد سمّی راحتتر و سریعتر است .              105

8 – در بعضی موارد ، قهوه ای شدن ناشی از فعالیت نوری در انتهای پایین ساقه ها را می توان با نگهداری انتهای پایینی ساقه ها در تاریکی در خلال کشت محدود نمود . نفوذ نور را می توان از طریق کدر کردن قسمتهای خارجی شیشه ها یا لوله های آزمایش تا سطح محیط کشت با پیچیدن کاغذ آلومینیومی در ته لوله ها یا با قرار دادن یک لایه نازک زغال غیر فعّال شده و آگار روی سطح محیط کشت ، جلوگیری نمود ( روجینی و همکاران 1986 ) .

9 – کاهش بافت زخمی ، منجر به کم شدن ترشحات می شود .

10 – کاهش غلظت نمک در محیط کشت سبب کم شدن ترشحات می شود .

11 – تنظیم کننده های رشد از طریق اکسیده کردن فنل ها ، نقش مهمی را در تیره کردن محیط کشت ، بازی می کنند . حذف تنظیم کننده ها می تواند سبب کاهش ترشحات شود .

12 – خیساندن قلمه ها در آب ، قبل از گذاشتن آنها در محیط کشت ، روش موثری در کم شدن ترّشح می باشد .

 

 

زغال چوب فعال[59]خنثي شده

دارای pH (5% در آب)  5-7 می­باشد. كلريد (Cl) کمتر از  01/0% می باشد و کمتر از  003/0 % فلزات سنگين می باشد.

      در دماي معمولي اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      غیر قابل حل در آب می باشد.

مراحل تهیه زغال فعال:

1- ابتدا زغال پودر شده و آسیاب شده را الک نموده ، آنگاه آن را درون بشر ریخته و روی آن اسید کلریدریک 2 نرمال می ريخته ميشود بطوریکه سطح زغال را بپوشاند.

2- بشر را روی هیتر قرار داده و بهم زده ميشود تا زمانی که به نقطه جوش برسد. زغال در اسید حدود نیم ساعت میجوشد.

3- در این مرحله محتویات درون بشر را توسط قیف بوخنر با دولایه کاغذ صافی، صاف کرده و آنگاه زغال صاف شده توسط آب مقطرجوشیده شستشو می گردد.

4- زغال شستشو داده را درون بشر ریخته و روی آن سدیم بی کربنات نیم نرمال (42 گرم در لیتر) اضافه ميشود. محتویات درون بشر را نیز مانند مرحله قبل به مدت نیم ساعت جوشانده، تا چربیهای آزاد شده توسط اسید در مرحله قبل، توسط بی کربنات، صابونی شده و حل گردد.

5- دوباره محتویات را صاف کرده و با اب مقطر جوشیده شستشو داده ميشود.

6- زغال صاف شده داخل آون با دمای 40 درجه قرار داده ميشود تا خشک گردد.

 

فلورو گلوسینول

در بعضی موارد اضافه شدن ترکیب فنلی فلوروگلوسینول[60] ، سبب ممانعت از تولید آنزیم IAA – اکسیداز که مسؤول تجزیه IAA می باشد می شود . جونز (1979 ) هانتر (1979 ) و جونز و هاپگود (1979 ) گزارش کرده اند که فلورو گلوسینول می تواند تشکیل شاخه های جانبی را تحریک کند . و اگر توأم با اکسین استفاده شود ، به صورت سینرژیک ، باعث تشکیل ریشه نابجا می شود . اثرات مثبت فلورو گلوسینول به هیچ وجه مشخص نیست زیرا آخرین تحقیقات نشان می دهد که این ماده می تواند فاقد اثر یا دارای اثر منفی ، روی تشکیل شاخه های جانبی و ریشه های نابجا باشد .

فلوروگلوسینول[61]

فرمول شیمیایی: C₆H₆O₃

وزن ملکولی: 1/126

  در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

  قابل حل در آب می­باشد.

 

5- 6- محیط کشت آماده تجارتی

از سال 1975 محیط کشت آماده ( پیش ساخته ) در بازار وجود دارد و کاربرد آن را در آزمایشگاهها ، مدارس ، صنعت و منزل ، خیلی آسانتر کرده است . نام شرکتهای تولید کنندۀ

            

115- ضد عفونی مواد گیاهی         

1-9- مقدمه

اساساً چهار منبع آلودگی ، وجود دارد : گیاه ( آلودگی داخلی و خارجی ) ، محیط کشت ( به
اندازه ی کافی ضد عفونی نشده باشد ) ، هوا ، و عدم دقت محقق . مهم ترین اینها ، خود گیاه است که مواد گیاهی بایستی بخوبی قبل از قرار گرفتن در محیط کشت ، ضد عفونی شوند . قبل از شروع ضد عفونی ف هر گونه بقایای خاک و قسمت های پوسیده ی گیاه ، بایستی از آن ف جدا شود ، و این عمل به وسیله ی شستن توسط آب ، انجام گیرد .

 اگر آلودگی خارجی خیلی زیاد باشد ( مثلاً سیب زمینی یا ریزوم که در خاک رشد می کند ) ابتدا بایستی اکر لایه های خارجی پوست سیب زمینی و یا لایه های خشک و کثیف پیاز را تمیز کرد . پس از آن مرحله ، ضد عفونی شورع می شود . برای ضد عفونی ، از الکل 70 درصد برای چندثانیه ، استفاده می شود . ( الکل 96 درصد خیلی قوی است و باعث دی هدراسیون شدید می شود ) . برای حذف حباب های هوا از مواد گیاهی و متعاقباً استریل کردن ، نمونه را برای مدت 10 تا 30 دقیقه در هیپوکلریت سدیم یک درصد ( NaClO ) که حاوی چند قطهر توین[62] ( 80 – 20 ) می باشد ، قرار داده ، و سپس برای از بین بردن اثر هیپوکلریت ، معمولاً آن را 3 بار به مدت 2 ، 5 و 15 دقیقه با آب مقطر استریل ، شستشو می دهیم . بعد از این مرحله ، می توان گیاه را در شرایط استریل ( در جایی که هوا جریان دارد ، با استفاده از وسایل استریل ، و گذران وسایل برش در الکل 96 درصد و سپس قراردادن آنها بر روی شعله نمونه را برش داد . اگر با وجود ضد عفونی مطمئن ، بعداً در مواد گیاهی آلودگی اتفاق افتاد ، به یکی از دلایل زیر است :

1- ممکن است آلودگی داخلی باشد ف که در بخش 4-9 به آن اشاره خواهد شد .

2- بی دقتی در کار ( نشستن دست ها ) ف که ضد عفونی نکردن میز کار با الکل 96 درصد ، استریل نبودن چاقو ، پنس ، پتری دیشها ، ورقه های درپوش ، محیط کشت ، کثیف بودن لباس کار و غیره . استفاده از ماسک بصورت ف پوشدن موها و استفاده از دستکش استریل ، می توانند میزان آلودگی را کاهش دهند .

 

3- نقص جریان هوای استریل در محفظه استریل محفظه تمیز ، بایستی سالی یک بار توسط یک نفر متخصص از کارخانه سازنده ، آزمایش شوند ، و فیلتر جلوی آن ، بطوری دوره ای ، عوض شود .

4- الکلی که از آن برای ضد عفونی وسایل استفاده می شود ، آلوده بوده ، که بهتر است این الکل بطور منظم عوض شود .

5- قرار دادن لوله ها و سایر وسایل آزمایش ، حامل محیط کشت در محیط غیر استریل ، بعد از ضد عفونی محیط کشت ، بایستی در شرایط استریل ، نگهداری شوند .

6- ضد عفونی نکردن کف اتاق کار ، بایستی پلاستیکی روی کفش ها کشیده شود ، و یا کف کش ها در مایع استریل ، قرار داده شوند .

7- اتاقی که محفظه ی تمیز در آن قرا داد ( تمیز نبوده و یا هوا در آن جریان داد ) . این مشکل را می توان از راه جریان هوای استریل یا به وسیله ی تابش اشعه ماورای بنفش ، در طول شب ، مرتفع کرد .

8- رفت و آمد زیاد افراد به اتاق کار ، باعث آلودگی کف و هوای آن می شود.

9- اغلب هنگامی که از اندامهای هوایی گیاه و قسمت هایی از گیاه که روی سطح خاک پهن شده است ، استفاده می شود ، آلودگی اتفاق می افتد ؛ زیرا استریلیزه کردن اینها ، کمی مشکل است . برای جلوگیری از این امر ، اندام های هوایی ، طی مراحلی ، استریلیزه می شوند . اندام های هوایی را ابتدا پس از شستشو و ضد عفونی ، تعدادی برگ از آن استریلیزه شده ، چند برگ جدا می شوند ؛ سپس عمل استریل ، مجدداً تکرار می شود . بطور کلی ، آلودگی توسط قسمت های هوایی ، هنگامی که هنوز کوچکتر هستند ، کمتر است . ترجیحاً باید یک مریستم همراه با چند برگ جدا شود . عیب آن ، این است که رشد آن در محیط این ویترو ، کندتر است .

10- اگر اتاق های رشد کاملاً تمیز نباشد . ( کف اتاقها مرتباً تمیز و ضد عفونی نشده اند ) آلودگی ممکن است در بعضی مواقع توسط کنه ها که ناقل بیماری های قارچی هستند ، انجام شود . از آن جا که این کنه ها براحتی از میان گلوله های پنبه ای و ورقه های پلاستیک درپوش ، عبور می کنند ؛ خطر این آلودگی ، قابل تخمین است . مناسب ترین روش برای ریشه کن کردن کنه ها ، استفاده از حشره کش نواری و پونا[63] به مدت چند هفته است ( بونگاو دورزان 1982 ) .

2-9- ضد عفونی شیمیایی           

ضد عفونی یا استریلیزاسیون شیمیایی ( از بین بردن میکرو ارگانیسم ها توسط مواد شیمیایی ) می تواند به صورت های ذیل , انجام شود :

1- الکل ( اتانول ) : از الکل 70 درصد ، برای ضد عفونی مواد گیاهی ، استفاده می شود ؛ زیرا الکل 96 درصد ، باعث دهیدراته شدن زیاد ، می شود . از الکل 96 درصد ، برای ضد عفونی ابزار و میزکار ، استفاده می شود ؛ چون استفاده از الکل 70 درصد ، سبب می شود که پس از تبخیر آن ، یک لایه آب بر روی آنها باقی بماند ، فرو بردن مواد گیاهی برای مدت چند ثانیه در الکل برای از بین بردن تمام میکرو ارگانیسمها ، کافی نیست چون الکل فقط موجودات سطحی را از بین می برد. ( برای حذف هوا ، الکل ، لایه اپی کوتیکولار را نیز در خود حل می کند ) و بعد از آن ، بایستی با هیپوکلریت ، ضد عفونی صورت گیرد . ضد عفونی سطحی میوه ها را می توان با فرو بردن آنها در الکل 96 در صد ، و سپس قرار دادن روی شعله انجام داد . این روش برای ضد عفونی بزور ارکیده نیز به کار رفته است .

2 – وایتکس ( هیپوکلریت سدیم ) : این ماده در اکثر فروشگاهها و خواروبار فروشی ها وجود دارد و دارای ده درصد ماده فعال است . معمولاً از هیپوکلریت سدیم یک درصد ، استفاده می شود . برای تهیه آن ، یک قسمت هیپوکلریت سدیم ( یا 10 درصد ماده فعال ) و 9 قسمت آب ، مخلوط می کنیم ، اگر چه گاهی از غلظتهای بالاتر ( 5/1 تا 2 درصد ) نیز می توان استفاده کرد . چنانچه گیاهان به هیپوکلریت سدیم حساس باشند ، از هیپوکلریت کلسیم برای ضد عفونی استفاده می شود .

روش هاي مختلف نگهداري محيط هاي كشت

الف- محيط كشت هايي كه برروي دستگاه لرزان قرار دارند.  سرعت دوران يكي ديگر از عواملي است كه برروي رشد كالوس، اندام زايي و  القاء جنين زايي سوماتيكي موثر است. مندرجات جدول 6-24 نشان ميدهد كه رشد كالوس جنين زا ميتواند تحت تاثير سرعت دوران محيط كشت قرار گيرد.

 

جدول 6-24: اثر سرعت هاي متفاوت تكان دادن محيط كشت برروي توليد كالوس درخت كاج پيسه آ ويلسوني (Yinggen and Zhongchen,1999).(Picea wilsonii).

سرعت دوران (دور در دقيقه)	حجم كالوس (گرم وزن تر در 100 ميلي ليتر)	درصد ميزان رشد كالوس
50	3،16	57،67
100	7،37	268،5
150	4،04	101،64
200	3،7	84،95

 

در اينجا ميزان رشد كالوس در سرعت دوراني 100 دور در دقيقه افزايش يافته است. همچنين به دليل وجود همبستگي منفي بين مدت زمان فاز توقف phase length) (lag كه باعث تاخير در تقسيم سلولي در شروع كشت ميگردد و سرعت دوران محيط كشت هيچگونه تفاوتي بين تيمار 50 و 200 دور در دقيقه مشاهده نمي گردد. از اين جهت است كه در سرعت دوران زياد و درنتيجه فاز تاخيري كوتاه تر، مصرف مواد غذايي محيط كشت سريعتر ميگردد. به همين شكل در سرعت 200 دور در دقيقه فاز لگاريتمي (logarithmic) تقسيم سلولي بلافاصله توسط فاز سكون و تنزلي تعقيب ميگردد و به اين دليل مواد غذايي موجود در كشت پس از گذشت پنج روز بطور كامل مصرف و سلولها پير شده و ميميرند. سرعت زياد دوران محيط كشت باعث ايجاد عوامل نامطبوع ديگر از قبيل غلظت زياد اكسيژن محلول كه براي كشت ها سمي ميباشد، استرس زياد ناشي از جداشدن سلولها از يكديگر و خروج گازكربنيك و هم چنين اتيلن ميشود. از اين جهت است كه در اغلب موارد سرعت 100 دور در دقيقه براي چرخش كشت ها انتخاب ميشود (Yinggen and Zhongchen, 1999).

  

.(Street, 1973; Martin, 1980) استفاده از بيوراكتور در مقايسه با كار در فلاسك هاي ارلن ماير داراي سودمندي هاي بيشتري از قبيل حجم بيشتر توليد مواد گياهي، كشت يكنواخت تر و امكان كنترل محيط كشت بهتر ميباشد(Tautorus and Dunstan, 1995) . قبل از اینکه مواد اوليه گیاهی به بیو راکتور منتقل گردند باید یک عمل پیش کشت را پشت سر بگذارند. بدین صورت که مثلا در یک بالن ارلن مایر به حجم 750 میلی لیتر كه حاوی حدود 200 میلی لیتر محیط کشت حاوي کینتین است، مقدار 1-2 گرم سلول به اندازه هاي (90-250  µm)اضافه می گردد و سپس برروي دستگاه لرزاننده قرار داده ميشود. این پیش کشت وظیفه تکثیر اولیه مواد را بعهده دارد. پس از گذشت ده تا چهارده روز از شروع كشت، تمام محتویات درون ارلن مایر یعنی مواد گیاهی و محیط کشت به بیو راکتور منتقل می گردد. در مورد کشت های درون ظروف کشت معمولی نیز روش به همين شكل است، با اين تفاوت كه سلولها به جای بیوراکتور به ارلن مایر هاي جدید منتقل می گردند. بديهي است برای اینکه سلولها قدرت تقسیم خود را حفظ نموده و برای مدت زیادی زنده بمانند بایستی هر یک تا دو هفته یکبار مرتبا باز کشت گردند. البته مدت مورد نياز جهت بازکشت بستگی به عوامل دیگری مثل نوع گیاه نیز دارد که باید برای كشت سلول هر گياه خاص مشخص گردد. راحت ترین روش بازکشت اینست که کشت تعلیق سلولی هر یک هفته یکبار به نسبت یک به پنج ویا هر دو هفته یکبار به نسبت یک به ده با محیط کشت جدید رقیق گردد.

ج‌-     دستگاه دیگري که اغلب می تواند جای شیکر را بخوبي بگیرد و درضمن عمل هوادهی به نمونه ها را به نحو احسن انجام دهد، دستگاه اكسوفيتون ((Auxophyton می باشد (تصوير 6-7). اين دستگاه ها طوري ساخته ميشوند كه كشت هايي را كه درون لوله هايي مخصوصي قرار دارند را در حول محور افقي بچرخاند. دستگاه اكسوفيتون اين امكان را فراهم ميكند كه درون لوله هاي كشت يك حالت جريان چرخشي ارام از مايع بوجود بيايد و از اين طريق به نمونه هاي مورد كشت اين اجازه را بدهد كه متناوبا از محلول كشت خارج شده و پس از هوادهي دوباره در ان غوطه ور گردند. در اين حالت در مقايسه با كشت هاي درون ارلن ماير هايي كه در روي دستگاه لرزاننده قرار دارند، در دستگاه اكسوفيتون سلولها با

ح‌-      خطر كمبود اكسيژن و خفگي در محلول كمتري روبرو ميگردند. به همين دليل كشت ها در اين دستگاه حتي بهتر از محيط هاي كشت نيمه جامد رشد مينمايند.

 

امروزه دستگاه اكسوفيتون در تعداد زيادي از ازمايشگاه هاي كشت بافت در خارج از كشور مورد استفاده قرار ميگيرد و حتي بر اساس ساختمان ان دستگاه هاي ديگري نيز ساخته شده كه بجاي لوله هاي استوارد، ارلن ماير ها در روي انها قرار ميگيرند و اندامهاي مورد كشت متناوبا از محلول غذايي خارج شده و بدين وسيله هوا دهي ميشوند. اما همانطور كه گفته شد اين دستگاه ها نيز از لحاظ ساختمان و كار كرد اقتباسي از دستگاه اكسوفيتون استوارد ميباشند(Krikorian, 2000) . طبق تجربيات نگارنده در مقايسه با كشت درون ارلن ماير ها، تشكيل جنين هاي رويشي گياه هويج در لوله هاي تي شكل دستگاه اكسوفيتون استوارد به مراتب بهتر انجام ميگردد(Mashayekhi, 2001) . در این دستگاه در روی صفحات چوبی چرخان که با افق زاويه 10 تا 12 درجه دارند و یک تا دو دور در دقیقه بدور خود میچرخند، گیره هایی وجود دارد که لوله های تی شکل که درب انها به قطر تقریبا 1.5 سانتیمتردر وسط انها قرار دارد، به انها متصل می گردند. با حرکت دورانی این صفحات بدون اینکه محیط کشت از درون این لوله ها به خارج بریزد، عمل هوادهی به نمونه ها انجام می پذیرد. این لوله های تی شکل  (T)به قطر داخلی 3 سانتیمتر دارای حجم حدود 70 میلی لیتر بوده که فقط 15 میلیتر محیط کشت درون انها ریخته می شود. در حین گردش تیوب ها نمونه ها توسط لایه ای از محلول محیط کشت به جداره لوله ها چسبیده و بدین طریق هوا دهی به انها بخوبی انجام می گردد(Street, 1973) . استفاده از این روش یعنی کشت درون تیوپ های واقع بر روی دستگاه اكسوفيتون جهت بررسی های فیزیولوژیکی بیوشیمیایی بسیار کارامد تر و نتیجه بدست امده بسیار مطلوب تر از کشت های درون ارلن مایر های روی دستگاه لرزان و همچنین کشت روی اگار می باشد. البته غير از موارد ذكر شده كشت اكسپلنت ها برروي كاغذ هاي صافي شناور برروي محيط كشت مايع و يا برروي اسفنج، گلوله هاي شيشه اي  و ساير مواد نيز امكان پذير ميباشد كه محقق بر اساس امكانات موجود از انها استفاده ميكند.

چ- آگارها

نوع ديگر از طرق نگهداري محيط هاي كشت محيط هاي جامد مانند اگار ها ميباشند.

اگار يك پلي ساكاريد مركب است كه از جلبك قرمز بدست ميايد. اگار از دو قسمت اگارز به ميزان حدود 70 درصد و اگاروپكتين به مقدار حدود 30 درصد تشكيل شده است. بخشي از اگار كه باعث توليد ژل ميگردد اگارز است. اگاررز پليمري متشكل از دو واحد تكرار شونده د-گالاكتوز و 6،3-انهيدروگالاكتوز ميباشد. اگاروپكتين كه پليمري از واحدهاي د-گالاكتوز سولفاته است خاصيت توليد ژل را ندارد. اگار در دماي 35 درجه سانتيگراد به شكل ژل در مييايد.  اگار هاي مورد استفاده در كشت بافت عبارتند از:

 

 

ميكروآگار:  يك آگار خالص شده با قدرت ژلي بالا و ويژگيهاي خوب جهت كاربرد در كشت بافت و سلول گياهي مي باشد. ميكروآگار مي تواند در حداقل غلظتي معادل با 5 گرم در ليتر جهت بدست آوردن ژل جامد بكار رود.

مشخصات عمومي
قدرت ژله اي	:  <900 گرم در سانتي متر مكعب
خاكستر سولفات	> : %6
كلسيم	:> ppm2000
بقاياي نامحلول	>:%5/0

 

5-2- فيتوآگار[64]

فيتوآگار يك آگار آزمون شده انتخابي ويژه كشت بافت گياهي بوده كه داراي قدرت ژلي بالايي مي باشد. فيتوآگار مي تواند در حداقل غلظتي معادل با 5 گرم در لتير جهت به دست آوردن ژل جامد به كار رود.

مشخصات عمومي
قدرت ژله اي	حداقل 1600 گرم در سانتي متر مكعب
رطوبت	> : %6
محتواي خاكستر	: >%5/10

 

5-3- آگارز[65]

آگارز يك هيدروكلوئيد گالاكتون خطي مي باشد كه بسيار خالص شده و از گونه هاي ژليديوم[66] كه يك علف هرز دريايي مي باشد استخراج مي شود.

ماتريكس ژلي تشكيل شده توسط آگارز تقريبا براي انتشار و جنبش الكتريكي پليمرهاي زيستي نظير DNA و RNA مناسب مي باشد. آگارز SPI دوچفابيوكمي جهت الكتروفورز اسيدهاي نوكلئيك بزرگتر ازbp 1000 بطور ايده آل مناسب مي باشد. اين تركيب نيز يك آگارز بسيار خالص مي باشد كه از گونه­هاي ژليديوم استخراج شده است. آگارز SPI براي كارهاي مقدماتي نظير اسيدهاي نوكلئيك تجزيه اي، توصيه مي شود. آگارزSPI با كيفيت تضمين شده جهت تاًمين نياز صريح اسيد نوكلئيك مورد استفاده به كار مي رود. آگارزSPI تحت شرايط بسيار دقيق ساخته مي شود و كيفيت جهت ايجاد تعادل بين نيازهاي تقاضاي اسيدهاي نوكلئيك و ميزان مصرف، كنترل مي شود.

توضيحات[67]

5-4- قدرت ژلي[68]

نيرويي كه مي­بايست به­كار رود تا سبب جدا شدن ژل شود.

5-5- دماي ژلي[69]

دمايي كه در آن يك محلول آگارز آبكي با سرد شدن به ژل تبديل مي شود. نقطه ژلي[70] يك محلول آگارز، همان دماي ذوب شدن آن نمي باشد.

محتواي سولفات[71]ممكن است بعنوان يك تشخيص دهنده خلوص بكار رود، زيرا كه سولفات تنها گروه اصلي موجود مي باشد.

5-6- الكترو اِندوسموسيس[72]

حركت مايع بر روي ژل به سمت قطب مثبت بدليل حركت الكتريكي اسيدهاي نوكلئيك در مسير قطب منفي،  EEOي قطب منفي مي تواند با تبديلات داخلي، جداسازي را قطع كند.

پديده EEO بدليل مهاجرت كاتوينهاي ناجور و آبگيري آنها در اطراف قطب منفي مي­باشد. گروههاي غير يوني[73] در ژل آگارز به ماتريكس ضميمه شده و بنابراين از چنين حركتي ممانعت بعمل مي آورد.

قدرت ژلي%1	:<1200 گرم بر سانتي­متر مكعب
قدرت ژلي %5/1	:<2700 گرم بر سانتي­متر مكعب
دماي ژله اي شدن	: 35-37 درجه سانتي­گراد
دماي ذوب	: 87-89 درجه سانتي­گراد
سولفات	: > %09/0
الكترواندوسمسيس	: 08/0-12/0
بقاياي residue on ignition	: > %5/0
ضايعات خشك كردن	: > %5
پيوندهاي DNA	تشخيص داده نشده
فعاليت آنزيمهاي DNAآز و RNAآز	تشخيص داده نشده

                             در دماي معمولي اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                             قابل حل در آب مي باشد.

5-7-آگارز1320

آگارز 1320 دوچفا بيوكمي بطور ايده آل مناسب الكتروفورز اسيدهاي نوكلئيك بيشتر از bp1000 مي باشد. اين يك آگارز با خلوص بالا مي باشد كه از گونه هاي ژليديوم استخراج مي شود. آگارز 1320 براي كارهاي مقدماتي نظير الكتروفورز اسيدهاي نوكلئيك توصيه مي شود كه در غلظت هاي پايين ژل بسيار سفتي را ايجاد مي كند.

آگارز 1320 با كيفيت تضمين شده جهت تأمين نياز صريح اسيدهاي نوكلئيك مورد استفاده بكار مي رود. آگارز 1320 تحت شرايط بسيار دقيق ساخته مي شود و كيفيت آن، جهت ايجاد تعادل نيازهاي تقاضاي اسيدهاي نوكلئيك و ميزان مصرفي كنترل مي­شود.

قدرت ژلي، %5/1 ژل	:<2400 گرم بر سانتي­متر مكعب
دماي ژله اي شدن	:34-37 درجه سانتي­گراد
سولفات	: > %09/0
الكترواندوسمسيس	: 07/0-11/0
بقاياي حاصل از احتراق residue on ignition	: > %1
ضايعات خشك كردن	: > %10
پيوندهاي DNA	تشخيص داده نشده
فعاليت آنزيمهاي DNAآز و RNAآز	تشخيص داده نشده

                             در دماي معمولي اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                             قابل حل در آب مي باشد.

 

5-8- آگارز­PPC با دماي ذوب پايين[74]

آگارز­PPC با دماي ذوب پايين به طور اختصاصي جهت كشيتهاي پروتوپلاست و استفاده در تكثير لاينها گزينش شده است ودر جائيكه درجه حرارت ژله اي شدن پايين، خطر مواجه شدن سلولها را با درجه حرارتهاي زيان آور مرتفع مي كند بكار مي رود. درجه حرارت ژله اي شدن پايين حدود 26 تا 30 درجه سانتيگراد به پرورش دهندگان[75] اين اجازه را مي دهد تا سلولها را درون محلول در 37 درجه سانتيگراد بدون نگراني از ژله اي شدن زود هنگام، دست ورزي[76] كنند.

خنك كردن آگارز تا درجه حرارت كمتر از 26 درجه سانتيگراد، سلولها را براي رشد همگروهي[77] يا ديگر آزمايشات غير­متحرك مي­سازد.

قدرت ژلي، %5/1 ژل	:<300 گرم بر سانتي­متر مكعب
دماي ژله اي شدن، %5/1	:26-30 درجه سانتيگراد
دماي ذوب	: > 65 درجه سانتيگراد
الكترواِندوسمسيس	: >10/0
رطوبت	: > %5
سولفات	: > %12/0

                             در دماي معمولي اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                             قابل حل در آب مي باشد.

 

5-9- آگارز سيپلاك[78]

آگارز سيپلاك بطور ويژه در تكثير لاينها مفيد واقع مي­شود و در جاهائيكه درجه حرارت ژله­اي شدن پايين، خطر مواجه شدن سلولها را با درجه حرارتهاي زيان­آور مرتفع مي­سازد به­كار مي­رود.

قدرت ژلي، %1 ژل	: <200 گرم بر سانتي­متر مكعب
دماي ژله اي شدن، %1sol???	: 26-30 درجه سانتي­گراد
دماي ذوب%1sol????	: > 65 درجه سانتي­گراد
الكترواندوسمسيس، -mr	: >15/0
رطوبت	:  > %10
سولفات	:  >%15/0

                             در دماي معمولي اتاق قابل نگهداري ميباشد.

                             قابل حل در آب مي باشد.

 

 

ژل رايت

ژل رايت يك پليمر ژلي طبيعي مي¬باشد كه مي­تواند با كاربردهاي متعدد بعنوان عامل جامد كننده محيط كشت به جاي آگار به مصرف برسد. ژل رايت توليد شده توسط تخمير ميكروبي يك پلي­ساكاريد آنيونی طبيعي بسيار خالص بوده كه ژلهاي سفت، محكم و شبيه ژل آگار را در حضور نمكهاي محلول نظير +2Mg و +2Ca  تشكيل مي‌دهد. ژلهاي تهيه شده از ژل رايت، بطور قابل توجهي در مقايسه با ژلهاي  تشكيل شده با آگار شفاف تر مي­باشند. ژل رايت حاوي هيچ گونه ماده آلوده كننده­اي نظير تركيبات فنلي، بطوريكه در آگار يافت شده اند و براي ارگانيسم هاي حساس معيني سمي مي­باشند، نمي¬باشد.

                    در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري مي¬باشد.

                    قابل حل در آب مي¬باشد.

                     توصيه مي شود كه به منظور اجتناب از كلوخه اي شدن،‌ ژل رايت توسط يك غربال، با محيط كشت مطابقت داده شود.

 

 

5-10- پودر موز[79]

از پودر موز بسيار منجمد شده بدون افزودنيها، توسط يخ زدن خشك توليد مي­شود. 100 گرم پودر موز معادل تقريبا 420 گرم ميوه تازه است. از پودر ميوه هايي با رنگ مايل به  قهوه­اي روشن استفاده كنيد. حداكثر رطوبت 4% مي­باشد.

      به صورت خشك در دماي معمولي اتاق قابل نگهداري مي­باشد.

کاراگینان[80]

كاراگنيان يك گروه طبیعی از پلي ساكاريدهایی مي باشد كه از جلبك دريايي قرمز در اثر سرد شدن در حضور كاتيونهاي مناسب نظير Ca²⁺ و K⁺ استخراج مي شود. پليمرهاي كاراگنيان  به يكديگر متصل مي شوند تا يك مارپيچ دوتايي بوجود آورند. اين مارپيچ ها مربوط به كاتيونهاي دو ظرفيتي به ويژه كلسيم مي باشند كه سبب تشكيل ماتريكس ژلي مي شود.

      در دماي معمولي اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب می باشد(در آب گرم/5گرم در لیتر).

 

کاپا کاراگینان[81]

کاپا كاراگنيان با آب پیوند برقرار می كند تا ژلهاي ترد، محكم و قوي تشكيل دهد. نمكهاي پتاسيم جهت تشكيل ساختار اين ژل سفت ضروري مي باشد. با افزايش سطوح پتاسيم، ساختار ژل بطور محكم تجمع مي يابد و ممكن است منجر به تشكيل رطوبت روی سطح ژل شود.

 

یوتا كاراگینان[82]

یوتا كاراگينان نيز با آب پيوند برقرار می کند اما در حضور نمكهاي كلسيم، ژلي خشك و كشساني تشكيل مي دهد. Ca²⁺ با ايجاد پيوند بين كاراگنيان و مولكولها مارپيچ­هايي را تشكيل مي دهد. بارهاي منفي مربوط به گروههاي سولفات بر روي مولكولهاي یوتا كاراگنيان اجازه تجمع به مارپيچ­ها را به اندازه مشابه در کاپا كاراگنيان نمي دهند.

 

ژل­کارین GP-812NF [83]

 ژل­کارین يك منبع خوب كاراگنيان جهت استفاده در كشت بافت گياهي مي­باشد و يك ژل سفت قهوه اي روشن تشكيل مي دهد. كاراگنيان مي­بايست در آب سرد پخش شود و سپس تا بالاتر از درجه حرارت انحلال خود حرارت داده شود تا حداكثر عملكرد به دست آيد. با خنك كردن و در حضور كاتيونهاي مناسب (Ca²⁺, K⁺) پليمرهاي كاراگنيان به يكديگر متصل شده تا مارپيچ هاي مضاعفي را تشكيل دهند. اين مارپيچ ها مربوط به كاتيونهاي 2 ظرفيتي نظيركلسيم   مي باشد كه ماتريكس ژلي را تشكيل مي­د هند.

      در دماي معمولي اتاق قابل نگهداري ميباشد.

       قابل حل در آب گرم می باشد.

  

LB آگار

LB آگار دارای مقدار کمی نمک بوده و در هر لیتر آن 10 گرم تریپتون، 5 گرم کلرید سدیم، 5 گرم عصاره مخمر و 10 گرم آگار آزمون شده میکروبیولوژی موجود می­باشد.

      بصورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      30 گرم از آنرا در 1 لیتر آب مقطر حل نموده و pHرا روی 2/7 تنظیم نمایید.

          آنرا در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل کنید.

LB آگار

LB آگار دارای مقدار بالای نمک بوده و در هر لیتر آن 10 گرم تریپتون، 10 گرم کلرید سدیم، 5 گرم عصاره مخمر و 10 گرم آگار آزمون شده میکروبیولوژی موجود می­باشد.

LB Broth

؟؟؟؟؟؟دارای مقدار کمی نمک بوده و در هر لیتر آن 10 گرم تریپتون، 5 گرم کلرید سدیم، 5 گرم عصاره مخمر موجود می­باشد.

   20 گرم از آنرا در 1 لیتر آب مقطر حل نموده و pHرا روی 2/7 تنظیم نمایید.

   آنرا در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل کنید.

LB Broth

؟؟؟؟دارای مقدار بالای نمک بوده و در هر لیتر آن 10 گرم تریپتون، 10 گرم کلرید سدیم، 5 گرم عصاره مخمر موجود می­باشد.

      بصورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      25 گرم از آنرا در 1 لیتر آب مقطر حل نموده و pH را روی 2/7 تنظیم نمایید.

      آنرا در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل کنید.

پودر آناناس[84]

عصاره خشک آبمیوه آناناس در آب قابل حل می­باشد و دارای 60% maltodextrines می­باشد. 100 گرم پودر معادل 650 گرم آناناس تازه می­باشد و ماده خشک میوه 40% است.

 

پلی اتیلن گلایکول 4000

پلی اتیلن گلایکول ترکیبی است که متوسط وزن مولی آن 3500-4500، عدد هیدروکسیل آن 25-32 و دمای ذوب آن بین 58 تا 61 درجه سانتیگراد می­باشد.

  در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

  قابل حل در آب می­باشد.

 

پلی اتیلن گلایکول 6000

پلی اتیلن گلایکول ترکیبی است که متوسط وزن مولی آن 700-5000، عدد هیدروکسیل آن 16-23 و دمای ذوب آن بین 56 تا 61 درجه سانتیگراد می­باشد.

 

پروپیلن گلایکول[85]

فرمول شیمیایی: C₃H₈O₂

وزن ملکولی: 10/76

  در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

  قابل حل در آب می­باشد.

آلژینات سدیم[86]

مخلوطي از اسيدهاي چند اوره­اي؟؟ مي­باشد كه متشكل از بقاياي D- مانورونيك اسيد و L-گولورونيك اسيدِ استخراج شده از جلبكهاي متعلق به راسته فائوفیسه[87] مي­باشد. آلژينات­ها به­عنوان عوامل ضخيم كننده و معلق كننده در تهيه ژلهاي قابل امتزاج[88] با آب به­كار مي­رود.

      در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب می­باشد.

 

 

نشاسته سیب­زمینی[89]

فرمول شیمیایی: (C₆H₁₀O₅)n

وزن ملکولی: n14/162

نشاسته سیب­زمینی دارای کمتر از 200 میلی­گرم در گرم رطوبت داشته و pHآن 6- 8 می­باشد.

      به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

 

نشاسته برنج[90]

      به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري مي­باشد.

 

پودر گوجه­فرنگي

پودر قرمز رنگ قابل حل در آب كه حاوي 25% نشاسته ذرت مي­باشد. 100 گرم پودر معادل 1 كيلوگرم گوجه فرنگي تازه مي­باشد و ماده خشك آن 75% مي­باشد. با غلظت 10- 5 گرم در ليتر مي­بايست به­كار برده شود.

 

عصاره مخمر[91]

یک مخمر خشک است که دارای محتوای آمینو نیتروژنی و ویتامینهای ب- کمپلکس محلول در آب می­باشد و به­دلیل محتوای پایین کلرید سدیم، جهت کشت بافت گیاهی بسیار مناسب می­باشد و نیتروزن کل آن حدود 8/9، آمینو نیتروژن حدود 1/5، کلرید سدیم حدود 3/0 و pH محلول 1 درصد آن، 7 می­باشد.

      به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

      قابل حل در آب مي­باشد.

 

آگار YPD[92]

در هر لیتر آگار YPD، 20 گرم دکستروز (گلوکز)، 20 گرم پپتون، 10 گرم عصاره مخمر و 10 گرم آگار تست شده میکروبیولوژی وجود دارد.

      به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري مي­باشد.

      60 گرم از آن را در 1 لیتر آب مقطر حل نموده و pH روی 2/7 تنظیم شود.

      ضدعفونی توسط اتوکلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه صورت می­گیرد.

 

آگار YT[93]

در هر لیتر آگار YT، 5 گرم کلرید سدیم، 8 گرم تریپتون، 5 گرم عصاره مخمر و 10 گرم آگار تست شده میکروبیولوژی وجود دارد.

      به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري مي­باشد.

      27 گرم از آن در 1 لیتر آب مقطر حل شود.

      ضدعفونی توسط اتوکلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه صورت می­گیرد.

 

YPD Broth

در هر لیتر آگارYPD Broth، 20 گرم دکستروز (گلوکز)، 20 گرم پپتون، 10 گرم عصاره مخمر وجود دارد که 50 گرم از آن جهت تهیه 1 لیتر از محلول نهایی به­کار می­رود.

  به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري مي­باشد.

  50 گرم از آن را در 1 لیتر آب مقطر حل نموده و pH روی 2/7 تنظیم گردد.

  .ضدعفونی توسط اتوکلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه صورت می­گیرد.

 

YPDG Broth

در هر لیتر آگار YPDG Broth ، 1 گرم دکستروز (گلوکز)، 20 گرم پپتون، 10 گرم عصاره مخمر وجود دارد.

  به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري ميباشد.

  31 گرم از آن را در 1 لیتر آب مقطر حل نموده و 30 میلی­لیتر گلیسرول اضافه شود.

  .ضدعفونی توسط اتوکلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه صورت می­گیرد.

 

YT Broth

در هر لیتر Broth YT، 5 گرم کلرید سدیم، 8 گرم تریپتون، 5 گرم عصاره مخمر وجود دارد.

  به­صورت خشک در درجه حرارت معمولی اتاق قابل نگهداري مي­باشد.

  18 گرم از آن در 1 لیتر آب مقطر حل شود.

  ضدعفونی توسط اتوکلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه صورت می­گیرد.

در نهايت بايستس توجه داشت كه وقتي نمونه هاي مورد كشت در محيط هاي مختلفي كه از لحاظ خصوصيات فيزيكي با يكديگر متفاوت هستند قرار ميگيرند، رفتار هاي مشابهي را بروز نميدهند و درنتيجه در انها اختلافات مورفولوژيكي مشاهده ميگردد. بطور مثال وايت و اسكوگ در كشت تنباكو مشاهده نمودند كه درمحيط محلول مقدار بيشتري ساقه، نسبت به محيط كشت اگار تشكيل ميگردد. در بعضي از منابع اورده شده است كه در كل براي تشكيل جنين رويشي و ايجاد شاخ و برگ شرايط نسبتا بيهوازي مناسب تر بوده و انرا تسريع ميكند؛ در حاليكه در شرايطي كه محيط كشت داراي تهويه بهتري است، تشكيل ريشه تسريع ميشود(Staba, 1980) . ازمايشات ديگر نيز مشخص نموده كه میزان هوادهی و مقدار و غلظت اکسیژن محلول در محیط کشت بر روی کشت در حال رشد در بیوراکتور ها اثر می گذارد(Tatic et al. 1991 , Kim et al., 1991b) . مثلا میزان هوادهی برروي رشد سلولها اثر گذاشته و مقدار زیاد ان باعث کاهش محصول سبزینه ای میگردد. بطور کلی میزان اکسیژن مورد نیاز سلولهاي گونه ها و لاین های مختلف گیاهی مورد كشت، متفاوت است. در هر صورت براي بهبود و تامين هوادهي كشت هاي محلول ميبايستي انها بين يك تا صد و پنجاه دور در دقيقه تكان داده شوند. بعضي از كشت ها از قبيل كشت كالوس هويج اگر بطور دوره اي در محيط كشت غوطه ور شده و از ان خارج شوند رشدشان بيشتر ميگردد (Staba, 1980). در مقايسه با كشت هاي روي دستگاه لرزان اين غوطه ور شدن دوره اي در اندامهايي مانند دمبرگ هويج باعث تسريع در رشد و ظهور اندامها و جنين هاي رويشي ميگردد. غوطه ور شدن دوره اي اندامها در محيط كشت توسط كشت انها درون لوله هاي تي شكل و يا ستاره اي شكل (ظروف كشت استوارد) و قرار گرفتن انها برروي صفحات عمودي و چرخان دستگاه اكسوفيتون كه با افق زايه بين 10 تا 12 درجه دارند و در دقيقه يك تا دو دور حول محور خود ميچرخند، ميسر ميباشد. در همين رابطه لازم به توضيح است كه مقدار محلولي كه در هر ظرف كشت ريخته ميشود ميبايستي بدقت ازمايش شود تا با انتخاب حجم مناسب محلول نمونه ها در ان بخوبي رشد و نمو نمايند.

بنظر ميرسد كه تنها اكسيژن برروي چگونگي رشد كشت درون شيشه تاثير گذار نيست، بلكه دی اکسید کربن موجود در داخل لوله ازمایش نیز بر روی جنین زایی و اندام زایی موثر ميباشند. بطور مثال افزايش غلظت دی اکسید کربن و اتیلن ميزان رشد بعضی از کشت های سلولی گیاهی مانند كشت سلولهاي گياه تاليكروم روگوزوم (Thalicrum rugosum) را از طریق ممانعت از اثر بازدارندگی هوادهی زیاد و يا جلوگيري از سنتز مواد ثانويه متابولیکی مانند بربرين(Berberine)  كه يك نوع الكالوئيد ميباشد، بهبود ميبخشد (Ammirato, 1983b: Kumar et al. 1987, 1989: Kim et al. 1991b : Bisaria and Panda 1991) .

 

صفحات 106 تا 113   118 تا 121

6-6- نگهداري محيط كشت ماده غذايي

محيط كشت براي مدت زياد را مي توان در حرارت كم (5درجه سانتي گراد ) و در تاريكي نگهداري كرد . در طول نگهداري دراز مدت بايد دقت كافي مبذول شود كه از تبخير زياد آب از محيط كشت ،  جلوگيري شود . بنابراين ،توصيه ميشود كه اتوكلاو شده ، در كيسه هاي پلاستيكي از قبل استريل شده و كاملا تميز ، بسته بندي شوند . در صورت امكان بايستي از نگهداري طولاني محيط كشت احتراز نموده ، زيرا بعضي مواد ، مثل IAA در آب ناپايدار هستند .

فصل هفتم

نحوه انسداد درب لوله هاي آزمايش و ظروف

ازيك سو،‌ لازم است كه درب لوله هاي آزمايش و ظروف (‌فلاسكها)، براي جلوگيري ازخشك شدن و آلودگي ، بسته شوند ، و از سوي ديگر، براي جلوگيري از كم شدن اكسيژن و جلوگيري از جمع شدن دي اكسيد كربن و اتيلن ، بايستي امكان مبادله گازها با خارج ، وجود داشته باشد. بستن درب ، واسطه اي است بين اين دو نياز، وبا وسايل زير ، مي توان آن را انجام داد :

1. گلوله هاي پنبه اي :  قبلاً ازگلوله هاي پنبه اي كه با دست ساخته مي شدند، زياد استفاده مي شد. متراكم كردن آنها ، با زحمت زيادي همراه بود ؛‌ولي اكنون ، ماشينهاي وجود دارند كه قادرند گلوله هاي پنبه اي را متناسب با لوله ها و ظروف ، بسازند. قبلاً گلوله هاي پنبه اي ، پس از انتقال نمونه به محيط كشت ، سوزانده مي شدند ، ولي انجام اين كار براي پنبه هاي مصنوعي كه توليد گازهاي سمي مي كنند ،‌امكان پذير نيست.

2. در پوشهاي معمولي : اين در پوشها ، سلولزي بوده و داراي خلل و فرج هستند كه مي توان آنها را به داخل لوله آزمايش ، فشار داد .

 

3. در پوش آلومينيومي ، كه بر رو ي شيشه ، با يك گيره ، ثابت مي شود.

4. شيشه هاي شفاف با درپوشهاي مصنوعي ، كه مي تواند اتوكلاو شوند.

5. لوله ها يا ظروف داراي سرپيچ ، كه بايستي مواظب بود محكم پيچيده نشوند ، زيرا تبادل گازي ، انجام نخواهد شد .

6. ورقه هاي آلومنيومي : اين ورقه ها ، بيشتر براي ظروف ارلن ، استفاده مي شود.

7. درپوشهاي پلاستيكي ( اسفنجي )

ازهفت روش بستن درب ظروف كه درفوق ذكر شد ، بجز روشهاي 5 و 6 بقيه احتياج به روش بستن ثانويه دارد ، كه لازم است براي جلوگيري از تبخير و آلودگي بيشتر ، بسته شوند.

در اروپا از نوعي پارافيلم و ورقه هاي آلومنيومي ، به عنوان وسيله اي براي بستن درب ظروف ، استفاده مي شود. البته ساير ورقه هاي محافظتي ، مانند ورقه هاي نازك پلاستيكي پي وي سي و ورقه هاي پلي اتيلن نيز استفاده مي شود. ورقه استفاده شده ، بايستي امكان تبادل گازكربنيك ، اكسيژن ، اتيلن و غيره را فراهم آورد ، ولي اجازه هدر رفتن آب را ندهد. به دلايل زير ، درپوشهاي لوله هاي آزمايش و ظروف ، مي توانند ما را از رسيدن به نتيجه ، دور نمايند :

1. اگر درپوش آن قدر محكم باشد كه تبادل گازهاي كربنيك و اكسيژن واتيلن به زحمت انجام شود يا اصلاً انجام نشود ، تجمع اين گازها ، مي تواند مسأله آفرين باشد . ورقه هاي آلومنيومي و پلي اتيلن ، اين مزيت را دارند كه مي توانند درب ظرف را كاملاًً ببندند. درپوشهاي پلي اتيلن ( ساخت كارخانه هاي كيمبل ) براي گازها ، قابل نفوذند ، لوي براي بخار آب ، قابل نفوذ نيستند.

2. لوله هاي مصنوعي ، جعبه ها و درپوشها كه اتيلن از خود پخش مي كنند ، چنانچه درب آنها خيلي محكم بسته شود ، مضرند.

3. هنگامي كه يك لوله بطور كامل بسته است ،‌تبخير به ميزان زيادي ، كاهش خواهديافت ،‌و درنتيجه رطوبت داخل لوله ، خيلي بالا خواهد رفت ، بخصصو گياهان داخل آنها كه ممكن است حالت شيشه اي بخود بگيرند ، احتياج به رطوبت كمتري دارند.

4. نوع درپوش ، بر روي ميزان نور قابل دسترس براي محيط كشت ، تأثير دارد. شيشه و درپوشهاي مصنوعي ، در مقايسه با گلوله هاي پنبه اي و ورقه هاي آلومينيومي ،‌اجازه عبور نور بيشتري را مي دهند. ميزان ازدست رفتن آب از لوله هاي آزمايش كه به روشها يا مواد مختلفي بسته شده اند ، در حضور نور فلورسنت ، به ميزان 1 وات در متر مربع ، و در 25 درجه سانتي گراد كه درمدت 5/3 ماه اندازه گيري شده اند ، بر حسب ميلي گرم از هر سانتي متر مربع سطح لوله هاي آزمايش به قرار ذيل بوده است :

 

نوع درپوش	آب از دست رفته ( ميلي گرم درسانتي متر مربع )
گلوله پنبه + ويتافيلم + ورقه آلومينيومي	124
گلوله پنبه + ورقه آلومينيومي	253
گلوله پنبه + ويتافيلم	852
سرپوش فلزي + ويتافيلم	710
سرپوش فلزي	930
ويتافيلم	1105

 

تحقيقات اخير ، نشان داده است كه بستن كامل لوله هاي آزمايش ، اثرات زيادي روي كشت ، دارد. دي پروفيت و همكاران (1986) ، نشان داده اند كه درب فلاكسهاي حامل قلمه هاي Magnolia soulangiana محكم بسته شده است . غلظت Co₂ و اتيلن در آن بالا بود و سبب كاهش رشد مواد گياهي و كلروزه شدن گياهان شد . ولترينگ (1986) با كاشت قلمه هاي جربرا در ظروف پلي پروپلين ، نتيجه گيري كردند كه درسيستم بسته بدون جذب اتيلن ، غلظت اتيلن و Co₂ افزايش يافت و منجر به اثرات زيان آوري براي رشد گياه شد.

 

فصل هشتم

مواظبت ازمواد گياهي :

براي كشت بافت ، از دو نوع مواد گياهي ، مي توان استفاده كرد . موادگياهي كاشت شده در شرايط تحت كنترل درگلخانه ( يا اتاقكهاي رشد ) و يا گياهاني كه در شرايط مزرعه رشد كرده باشند. اگر از مواد گياهي كه در شرايط مزرعه رشد كرده اند ، استفاده شود ؛‌ احتمال آلودگي ، بيشتر است ، مگر آن كه آنها را ازبافتهاي داخلي گياه ، مانند بافتهاي منطقه لايه زاينده يك درختچه يا درخت ، يا ازقسمت هاي قوي گياه ، مانند جوانه ها ، غده ها و ريشه هاي ذخيره اي و غيره ، جدا نماييم. ( گوترت 1959) . چنانچه علي رغم وجود معايب فوق ، لازم باشد كه از مواد گياهي موجود ، در شرايط مزرعه ، استفاده شود ؛ بايستي مسايل ذيل را رعايت كرد.

1. بايد از جوانه با فلس روي آن ( كه جوانه در حالت خواب نباشد ،‌اگرچه هنوز جوانه بازن شده باشد ) استفاده كرد.

2.از شاخه هايي كه قبلاً‌ ذخيره شده اند و بعداً در داخل آب قرارداده شده اند ، مي توان استفاده كرد .

3. شاخه ها را مي توان در پلاستيك پيچيد ، و فقط قسمت هايي را كه بعداً تشكيل مي شوند ، براي كشت بافت ،‌جدا نمود.

4. از جوانترين قسمتهاي هوايي گياه ، استفاده شود. به علت آلودگي زياد مواد گياهي موجود در مزرعه ، اغلب لازم است كه از مواد گياهي كه در گلخانه ويا اتاقكهاي رشد ، رويانده شده اند ، استفاده شود. در صورتي كه مجبور به استفاده از مواد گياهي خارج از گلخانه باشيم ، ابتدا از گياه را بايستي در داخل ظروف ، مجدداً رشد داد ، و از بافتهاي جديد ، براي كشت بافت ، استفاده كرد.

بالاخره براي كاهش آلودگي ،‌هنگامي كه از مواد گياهي گلخانه يا اتاقكها رشد استفاده مي كنيم ، بايستي به نكات زير، توجه داشته باشيم :

1. جلوگيري از آلودگي توسط حشرات ( شته ها ، كنه قرمز ، مگس سفيد ، و غيره ) زيرا اين حشرات ، اغلب ، ناقل بيماريها هستند.

2. جلوگيري از آلودگي باكتريايي و قارچي ، با به كاربردن سموم قارچ كش وباكتري كش.

3. عدم استفاده ازآب آلوده ، زيرا آب ، يكي ازعوامل مهم در تكثير و پراكنده شدن ميكروارگانيسم ها است ، و اين موضوع براي گياهاني كه حالت پخش شده روي زمين دارند ، مهم است .

4. رطوبت گلخانه ، درحد ممكن ، پايين نگه داشته شود،  زيرا قارچها و باكتريها ، رطوبت رادوست دارند.

5. به گياهان ، اجازه دهيم كه قبل ازشروع ضد عفوني و جدا سازي نمونه ، خشك شوند.

بورن ( 1977) اختلاف درآلودگي بين گياهان را كه در شرايط مختلفي روييده اند ، بخوبي نشان داد. وي متوسط تعداد ميكروارگانيسمها را به ازاي هر عدد گل سيب زميني ، مشخص كرد ، و به نتايج زير ، دست يافت :

 

منبع كل	ضد عفوني نشده	ضد عفوني شده	درصد آلودگي در محيط كشت ،‌پس از ضد عفوني
مزرعه	1300000	92000	100
گلخانه	85520	1600	60
فيتوترون	90	43	30

 

اگر مواد گياهي ، حاصل از درختچه ها باشد كه براي مدت كوتاهي براي تحقيق در دسترسند ( اغلب قبل از اين كه جوانه ها باز شوند ) استفاده ازروش مناسب ، مهم است (‌استفاده ازپلاستيك ،‌براي جلوگيري از خشك شدن درطي مرحله نگهداري در درجه حرارت پايين . ) براي به دست آوردن اطلاعات بيشتر در اين مورد ، مي توان به مقاله بونگاو و دورزان ( 1982 ) مراجعه كرد.

اساساً براي آزمايش ، بايستي از گياهان قوي و سالم ، استفاده شود ، زيرا گياهان ضعيف ،‌حساسيت بيشتري به بيماريها دارند. استفاده از مواد گياهي سالم ، مهم است (‌گياهان بدون ويروس ، باكتري ، قارچ ، كنه و غيره ) براي توليد درمقياس زياد ، بايستي مواظب بود كه ژنوتيپ مناسب ، به كار برد. معيارهاي ژنوتيپ خوب ، عبارتند از : سرعت رشد ، زود رسي ، ميزان توليد گل ، رنگ گل ، شكل گل ، كيفيت ،‌و غيره . به اين دلايل اغلب درتحقيقات ،‌از موادگياهي متجانس ( همه در يك مرحله ازرشد ، باشند ) استفاده ميكنند.

توصيه مي شود كه از مواد گياهي كاشته شده در گلخانه يا اتاقك رشد كه كنترل رشد و نمود در آنها آسانتر است ، استفاده شود. درباره جزئيات مربوط به اثر مواد اوليه در رشد و نمو گياهان درمحيط كشت ، درفصل 13 بحث شده است.

3. هيپوكلريت كلسيم : اين ماده ،‌به صورت پودر است ،‌و مي توان آن را بخوبي در آب معمولي حل نمود و محلولي شفاف به دست آورد ( اغلب صاف مي شود ) . براي ضد عفوني مواد گياهي ،‌آنها را به مدت 5 تا 30 دقيقه ( با غلظت بين 35 تا 100 گرم در ليتر) در آن فرو مي بريم . هيپوكلريت كلسيم نسبت به هيپوكلريت سديم ،‌آهسته تر وارد بافتهاي گياهي مي شود ، و هنگامي كه به صورت محلول در آمد ، فقط براي مدت زمان محدودي ، مي توان آن را ذخيره كرد.

4. كلريد جيوه محلول در آب : اين ماده ،‌براي گياه ،‌انسان ودام، خيلي سمي است ، و غلظت 01/0 تا 05/0 درصد ( وزني به حجمي ) براي مدت 2 تا 12 دقيقه جهت ضد عفوني ، به كار مي رود. شستشو بايد با دقت انجام شود و محلول هاي باقي مانده از شستشو را نبايستي داخل ظرف شويي ريخت .

ضد عفوني شيميايي موثرتر را مي توان به طرق زير ، انجام داد :

1. شستن موادگياهي با آب ، قبل از ضد عفوني ، و اجازه خارج شدن كامل آب از سطح آن، هوگز( 1981) نشان داده است كه اين نحو شستشو ، بطور موثري ، آلودگي را در خانواده Gesneriaceae كاهش مي دهد.

2. قرار دادن موادگياهي در الكل 70 درصد براي چندثانيه قبل از ضد عفوني شيميايي، تا خروج حبابهاي هواي روي اندام گياهي و تأثيربهتر مواد ضد عفوني كننده ، روي مواد گياهي .

3. اضافه كردن ماده خيس كننده به مايع ضد عفوني كننده ( به غلظت 08/0 تا 12/0 درصد) . اين ماده ، تورژسانسس سطحي را پايين مي آورد ، و محلول هاي ضد عفوني، سطح تماس بهتري با موادگياهي ، خواهند داشت .

4. به هم زدن ماده ضد عفوني كننده درزمان استفاده ( با يك بهمزن مغناطيسي )

5. ضد عفوني نمودن با وايتكس ، تحت شرايط خلاء‌ . اين كار ، باعث مي شود كه حبابهاي هواي سطح مواد گياهي حذف ، وفرآيند ضد عفوني ،‌بنحو موثري ،‌انجام گيرد.

انتخاب زمان و غلظت ماده ضد عفوني كننده هيپوكلريت سديم ، بستگي به شرايط خاص و اين كه آيا لايه سطحي قلمه كه ضد عفوني ملايم مي شود ، درادامه آزمايش ازآن استفاده خواهد شد ، و يا اين كه قبل ازگرفتن نمونه در محيط كشت ، اين لايه حذف مي شود ، دارد.

بنابراين ، در مواردي،‌ضد عفوني با غلظت يك درصد هيپوكلريت سديم به مدت پنج دقيقه كافي باشد ، ولي بعضي اوقات ، 30 دقيقه وقت لازم است . ضد عفوني نمودن طولاني ،‌مي تواند اثرات زيادي روي قلمه داشته باشد. لذا  لازم است كه زمان وغلظت مناسب ماده ضد عفوني كننده ،‌براي هر نوع مواد گياهي، تعيين شود.

در ذيل ، چند مثال در مورد غلظتها و زمانهاي لازم ، آورده شده است :

- برگهاي گونه Anthurium andeanum : 30 دقيقه درمحلول يك درصد هيپوكلريت سديم .

- بافتهاي فلسي گياه Hyacinthus : 15 دقيقه در محلول يك درصد هيپوكلريت سديم.

- ساقه هاي روندرون (Rhododendron) : 20 دقيقه درمحلول يك درصد هيپوكلرپتاسيم .

- دمبرگهاي جربرا (Gerbera) : 15 دقيقه در محلول يك درصد هيپوكلريت سديم .

- جوانه هاي گل گياه Freesia : 20دقيقه در محلول يك درصد هيپوكلريت سديم.

- برگهاي گياه Strelizia : 45 دقيقه در محلول يك درصد هيپوكلريت سديم .

- بذور لاله (Tulipa) : 30 دقيقه درمحلول دو درصد هيپوكلريت سديم .

- ساقه هاي لوبيا (Phaseouls) : 10 دقيقه درمحلول يك درصد هيپوكلريت سديم .

- سرشاخه هاي گياه Nephrolepis : 5دقيقه در محللو يك درصد هيپوكلريت سديم.

دربعضي موارد ، براي جلوگيري از نفوذ ضد عفوني كننده و يا بيرون آوردن شيرابه ازمحل زخمها ( درگياهان خانواده فرفيون ) مي توان محلهاي زخم شده را به وسيله پارافين، پوشش داد.

3-9 - كشهاي بظاهر استريل

بايستي درنظر داشت كشتهايي كه به صورت استريل انجام مي شوند و به نظر استريل مي آيند ، ممكن است كاملاً استريل نباشد . اگر منشأ‌ آلودگي در داخل بافتهاي گياهي باشد ، آلودگي معمولاً هنگامي ظاهر مي شود كه محل آلوده ، قطع شده ، ودر هنگام تهيه واكشت ، امكان باز شدن و تماس با محيط كشت ، فراهم شود. اغلب آلودگي بعد از تهيه چند واكشت ، آشكار مي شود. رشد ضعيف و يا كلروزه شدن بافتها ، مي تواند نشانه يك نوع آلودگي داخلي ، مثلاً به باكتري Erwinia carotovora باشد ( فاس و ميلر 1978) . كشتهاي بظاهر ضد عفوني شده ، مي توانند در ارتباط با كشت درمحيط فقير كه برروي آن ، ميكرو ارگانيسم ها بندرت رشد ميكنند ، يا هرگز رشد نمي كنند ، نيز وجود داشته باشد . آلودگيها ،‌فقط هنگامي ظاهر مي شوند كه تلقيح بر روي يك محيط غني ، انجام شده باشد ، و يا اين كه درميكروارگانيسم ها ، موتاسيوني اتفاق افتاده باشد كه به آن اجازه دهد تا در محيط فقير، رشد نمايند.

براي اطمينان از ضد عفوني شدن كشت به يك قسمت ازسرشاخه ، مي توان آن را به صورت طولي بريده و سطح بريده شده را درم حيط كشت غني ، قرار داد. اين محيط كشت را مي توان به وسيله اضافه كردن 2 تا 3 درصد تريپتون يا پيتون ( مخلوطي ازچند اسيد آمينه و ويتامين )‌تهيه نمود. پس از چند روز ، تعداد بسياري زيادي ميكروارگانيسم ، رشد مي كند . ازآن جا كه محيط كشت مناسب براي بسياري ازباكتريهاي درو نزا كشف نشده است ،‌اين تكنيك ، هميشه كافي نيست . آلودگي داخلي در گياهان ، اغلب دراثر باكتري هاي ميله اي شكل به وجود مي آيد . اغلب اين باكتريهاي ساپروفيت درآزمايشگاه هاي ميكروبيولوژيكي ، آلودگي ايجاد مي كنند ؛ زيرا اسپور آنها ، قادر است شرايط نامساعد ، مثل : گرما ، خشكي، سرما ، اشعه ي ماوراي بنفش ، و مواد غذايي ضدعفوني كننده را تحمل كند. براي رهايي از اين آلودگي  ، لازم است كه ضد عفوني هوا ، كف آزمايشگاه و مواد گياهي،‌صورت گيرد.

 

4-9 - آلودگي هاي داخلي :

آلودگي داخلي ، مي تواند مشكل آفرين باشد ، و اغلب به علت وجود ميكروارگانيسم اتفاق مي افتد كه در داخل گياه هستند و نمي توان آنها را از طريق مواد ضد عفوني كننده خارجي ، دفع نمود. بطور كلي ، دو راه براي مبارزه با اين مسأله ، وجود دارد :

1. كشت مريستم ( زيرا ميكروارگانيسم ها در درون سلول هاي ناحيه مريستم ، وجود ندارند. )‌

2. اضافه كردن آنتي بيوتيك ، به محيط كشت .

از آن جا كه كشت مريستم خيلي پيچيده است ، و اضافه كردن آنتي بيوتيك به محيط كشت ، خيلي بي تأثير مي باشد ، ساده ترين راه ، استفاده ازمواد گياهي غير آلوده است.

اضافه كردن آنتي بيوتيك ها ،‌اغلب باعث پديده فيتوكسيك ( سميت گياهي) مي شود بطوري كه غلظتهاي زيادآنتي بيوتيك ، مانع رشد ونمو گياهان عالي ، وباعث ايجاد مقاومت در باكتريها مي شوند. استفاده از آنتي بيوتيك ها ، سبب گزينش ميكروارگانيسم مقاومت نيزمي شود.

هنگام استفاده اكثر آنتي بيوتيكها درمحيط كشت ، از استريليزاسيون استفاده مي شود. استيجل ( 1959) و فونتانت (1957) استفاده از پني سيلين ، آكرومايسين ، وديگران استفاده از تتراسيكلين و 8- هيدروكسي كوئينولين را تشريح نموده اند. استاريكسي و همكاران اثر آنتي بيوتيكهاي مختلف را (‌ اوكسي تتراسيكلين ، استرپتومايسين، كلرومايسين و پني سيلين ، ريفامسين ، جنتامايسين ) را بر روي كشت Crytocaryne و Cinchona كه از اول با باكتري ها شد ، و همزمان اثري بررشد و نمو قله ها ، نداشت.يانگ وهمكاران ( 1984) پي بردند به اين كه هيچ آنتي بيوتيكي نيست كه به تنهايي بتواند بر ضد آلودگيهاي باكتريها در كشت اندامهاي هوايي گياهان اثر داشته باشند، و تركيبي ازآنتي بيوتيكهاي مختلف ، اثر بيشتري در مقايسه با اثرات هر كدام به تنهايي ، دارد . اطلاعات بيشتر در رابطه با استفاده از آنتي بيوتيكها براي فايق آمدن برآلودگيهاي داخلي را ، مي توان ازگزارش جورج و شرينگتون به دست آورد. نامبردگان گزارش كرده اند كه دربعضي از موارد ، آنتي بيوتيكها باعث رشد زياد ( بعضي موارد ، خيلي زياد ) بافتهاي كشت شده ، مي گردند.

بطور كلي ،‌نتايج اضافه كردن آنتي بيوتيكها به محيط كشت گياهان عالي ، راضي كننده نيست . دبرگ ( مذاكرات شخصي ) به اين نتيجه رسيد كه جلوگيري از رشد ميكروارگانيسمها به وسيله اضافه كردن آنتي بيوتيك ، در تكثير گياهان به صورت تجارتي ، عملي نيست . هنوز مهمترين روش غلبه بر آلودگي داخلي كشت مريستم است ، كه به وسيله ترامير براي گلايول ، توضيح داده شده است.

 

 

5-9- كشتهاي همزيست

اگر چه از نظر تعريف ، كشت اين ويترو به كاشت گياهان در شرايط استريل اطلاق شده است ، ولي ميتوان آن را ، با استفاده از ميكروارگانيسمها نيز انجام داد .